王 玉，李 佳，陳廣云，王 萍

（淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 淮安 223300）

中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，建立在中藥成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，可實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥整體物質(zhì)的有效控制。自2010年版開始已載入中國藥典，具有分離效率高、分析速度快、檢測靈敏度高、方法重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，可反映待測樣品的特征性和整體性[1-2]。

女金片由鹿角霜、陳皮、當(dāng)歸、白芷、川芎、延胡索、甘草、牡丹皮、黃芩、阿膠、益母草等23味中藥按照一定的制法制成，是婦科常用中成藥，具有調(diào)經(jīng)養(yǎng)血，順氣化瘀之功效，臨床上用于經(jīng)血不調(diào)、趕前錯(cuò)后、腰腿酸痛等上述癥狀者[3-4]。目前多是關(guān)于女金片含量測定的報(bào)道，但其測定的成分較單一，不足以綜合反映女金片的整體質(zhì)量[5-7]。本試驗(yàn)采用高效液相法，以芍藥苷為參照峰，在選定的色譜條件下，標(biāo)定出9個(gè)色譜特征峰，建立了12批市售女金片的高效液相指紋圖譜，同時(shí)進(jìn)行了聚類分析，為女金片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立及其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀（DIONEX公司）；Milli-QR型超純水機(jī)（美國密理博有限公司）；XS205-DU型電子天平（均為METTLER公司，精度為十萬分之一）；XP-6型電子分析天平（均為METTLER公司，精度為百萬分之一）；KH72000DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

女金片均為市售（樣品S1～S12批號(hào)分別為1903201，1804201，2002202，2011201，20200104，20201101，20181001，20191101，20201001，180009，180010，180007）；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201943；含量95.1 %）；橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110721-201818；含量96.2 %）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201821；含量95.4 %），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純； 純化水為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[8-10]

色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，北京迪科馬科技有限公司）；流動(dòng)相：乙腈（A相）-0.05 %磷酸溶液（B相）按表1梯度洗脫；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫時(shí)間程序表

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取芍藥苷對(duì)照品2.104 mg、橙皮苷對(duì)照品2.041 mg、黃芩苷對(duì)照品3.946 mg，置入50 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取女金片細(xì)粉約1 g，精密稱定，置入20 ml量瓶，加入稀乙醇15 ml，超聲處理（功率160 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 參照峰的選擇 在女金片指紋圖譜中，通過與混合對(duì)照品圖譜對(duì)照（見圖1），指認(rèn)出4號(hào)峰為芍藥苷，4號(hào)峰的峰面積適中，分離完全，穩(wěn)定性較好，設(shè)為參照峰（S）。以下試驗(yàn)均以各供試品溶液色譜圖中4號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積值為參考，計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取女金片細(xì)粉約1 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬定色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于0.36 %，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取女金片細(xì)粉6份，各約1 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬定色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于0.71 %，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取女金片細(xì)粉約1 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0，2，4，6，10，16，24 h進(jìn)樣，按擬定色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于0.31 %，表明女金片供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 指紋圖譜的構(gòu)建 取女金片樣品（S1～S12），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行指紋圖譜測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012年A版）進(jìn)行數(shù)據(jù)導(dǎo)入、匹配、校正，建立女金片指紋圖譜共有模式。根據(jù)匹配結(jié)果確定9個(gè)共有峰，并生成對(duì)照指紋圖譜（R），見圖2。通過與對(duì)照指紋圖譜比較，計(jì)算各批次樣品的相似度（見表2）；以芍藥苷峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（見表3、表4）。由表中數(shù)據(jù)可見，S1～S12號(hào)樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均大于0.90，表明12批不同樣品具有良好的相似性。

表2 12批女金片指紋圖譜相似度

表3 12批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表4 12批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

圖2 12批女金片的指紋圖譜

2.4.2 共有峰的歸屬 取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，按擬定色譜條件進(jìn)樣，得到色譜圖（見圖1）。通過比較樣品和混合對(duì)照品指紋圖譜中共有峰的保留時(shí)間及紫外吸收光譜對(duì)共有峰進(jìn)行歸屬，確認(rèn)其中4號(hào)峰為芍藥苷，6號(hào)峰為橙皮苷，7號(hào)峰為黃芩苷。

2.4.3 聚類分析 以3個(gè)廠家12批樣品9個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為變量，采用SPSS 22.0軟件，以組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法及歐氏距離平方為測度對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖3。由圖3可見聚類趨勢，當(dāng)類間距為5時(shí)，12批樣品被聚為三大類：S1、S2、S3、S4聚為一類，S5、S6、S7、S8、S9聚為一類，S10、S11、S12聚為一類。每一類均為同一廠家產(chǎn)品，表明同一廠家產(chǎn)品質(zhì)量具有較高的穩(wěn)定性。

圖3 12批樣品聚類分析樹狀圖

3 討論

3.1 檢測波長選擇

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，不同成分在不同波長下有最大吸收。文獻(xiàn)采用230 nm測定女金片中芍藥苷的含量[5]，橙皮苷和黃芩苷的含量時(shí)選用280 nm[6-7]。本試驗(yàn)中采用DAD檢測器在200～800 nm波長對(duì)樣品進(jìn)行了全波長檢測，結(jié)合文獻(xiàn)[11-12]，比較不同波長下的圖譜。結(jié)果表明，230 nm波長處得到的色譜峰數(shù)目較多，信息較為全面，故選擇230 nm作為檢測波長。

3.2 供試品溶液的制備

本試驗(yàn)對(duì)供試品提取溶劑的種類（甲醇、稀乙醇）、提取方法（超聲、回流）和提取時(shí)間（15，30，60 min）進(jìn)行考察。結(jié)果表明，甲醇提取效率低，部分共有峰分離度不符合要求；超聲提取和回流提取的提取率無明顯差異，但超聲操作簡便，用時(shí)較短，故選擇稀乙醇超聲作為供試品溶液的制備方法。

3.3 指紋圖譜分析

本試驗(yàn)建立了女金片的指紋圖譜共識(shí)別出9個(gè)共有峰，克服了單一化學(xué)成分作為質(zhì)控指標(biāo)的難題，較好地反應(yīng)了該制劑的內(nèi)在質(zhì)量信息，為女金片的總體研究提供了理論參考依據(jù)。但本制劑藥味眾多，未能確認(rèn)出每個(gè)共有峰的歸屬，因此，需要進(jìn)一步完善該指紋圖譜中共有峰的確認(rèn)，為女金片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供更多的數(shù)據(jù)支撐。

3.4 聚類分析

12批女金片的指紋圖譜具有相同的色譜特征峰，但各色譜特征峰峰面積的相對(duì)比值有所差異。文獻(xiàn)表明，原料藥材來源及藥材質(zhì)量均會(huì)影響色譜峰峰面積，提示各廠家在選擇藥材投料生產(chǎn)前應(yīng)注意藥材成分含量的檢測。