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        女金片的HPLC指紋圖譜研究及聚類分析

        2021-11-04 15:26:32陳廣云
        食品與藥品 2021年5期

        王 玉,李 佳,陳廣云,王 萍

        (淮安市食品藥品檢驗(yàn)所,江蘇 淮安 223300)

        中藥指紋圖譜是一種綜合的,可量化的鑒定手段,建立在中藥成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上,可實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥整體物質(zhì)的有效控制。自2010年版開始已載入中國藥典,具有分離效率高、分析速度快、檢測靈敏度高、方法重現(xiàn)性好的特點(diǎn),可反映待測樣品的特征性和整體性[1-2]。

        女金片由鹿角霜、陳皮、當(dāng)歸、白芷、川芎、延胡索、甘草、牡丹皮、黃芩、阿膠、益母草等23味中藥按照一定的制法制成,是婦科常用中成藥,具有調(diào)經(jīng)養(yǎng)血,順氣化瘀之功效,臨床上用于經(jīng)血不調(diào)、趕前錯(cuò)后、腰腿酸痛等上述癥狀者[3-4]。目前多是關(guān)于女金片含量測定的報(bào)道,但其測定的成分較單一,不足以綜合反映女金片的整體質(zhì)量[5-7]。本試驗(yàn)采用高效液相法,以芍藥苷為參照峰,在選定的色譜條件下,標(biāo)定出9個(gè)色譜特征峰,建立了12批市售女金片的高效液相指紋圖譜,同時(shí)進(jìn)行了聚類分析,為女金片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立及其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        UltiMate 3000型高效液相色譜儀(DIONEX公司);Milli-QR型超純水機(jī)(美國密理博有限公司);XS205-DU型電子天平(均為METTLER公司,精度為十萬分之一);XP-6型電子分析天平(均為METTLER公司,精度為百萬分之一);KH72000DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

        1.2 試藥

        女金片均為市售(樣品S1~S12批號(hào)分別為1903201,1804201,2002202,2011201,20200104,20201101,20181001,20191101,20201001,180009,180010,180007);芍藥苷對(duì)照品(批號(hào):110736-201943;含量95.1 %);橙皮苷對(duì)照品(批號(hào):110721-201818;含量96.2 %);黃芩苷對(duì)照品(批號(hào):110715-201821;含量95.4 %),均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈(色譜純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);其他試劑均為分析純; 純化水為自制。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件[8-10]

        色譜柱:Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,北京迪科馬科技有限公司);流動(dòng)相:乙腈(A相)-0.05 %磷酸溶液(B相)按表1梯度洗脫;檢測波長:230 nm;柱溫:30 ℃;流速:0.8 ml/min;進(jìn)樣量:10 μl。

        表1 梯度洗脫時(shí)間程序表

        2.2 溶液制備

        2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取芍藥苷對(duì)照品2.104 mg、橙皮苷對(duì)照品2.041 mg、黃芩苷對(duì)照品3.946 mg,置入50 ml量瓶,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

        2.2.2 供試品溶液 取女金片細(xì)粉約1 g,精密稱定,置入20 ml量瓶,加入稀乙醇15 ml,超聲處理(功率160 W,頻率50 kHz)30 min,放冷,加稀乙醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

        2.3.1 參照峰的選擇 在女金片指紋圖譜中,通過與混合對(duì)照品圖譜對(duì)照(見圖1),指認(rèn)出4號(hào)峰為芍藥苷,4號(hào)峰的峰面積適中,分離完全,穩(wěn)定性較好,設(shè)為參照峰(S)。以下試驗(yàn)均以各供試品溶液色譜圖中4號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積值為參考,計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

        圖1 高效液相色譜圖

        2.3.2 精密度試驗(yàn) 取女金片細(xì)粉約1 g,精密稱定,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按擬定色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于0.36 %,表明儀器精密度良好。

        2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取女金片細(xì)粉6份,各約1 g,精密稱定,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按擬定色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于0.71 %,表明方法重現(xiàn)性良好。

        2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取女金片細(xì)粉約1 g,精密稱定,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別在0,2,4,6,10,16,24 h進(jìn)樣,按擬定色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于0.31 %,表明女金片供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.4 指紋圖譜的建立及分析

        2.4.1 指紋圖譜的構(gòu)建 取女金片樣品(S1~S12),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備,按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行指紋圖譜測定,采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2012年A版)進(jìn)行數(shù)據(jù)導(dǎo)入、匹配、校正,建立女金片指紋圖譜共有模式。根據(jù)匹配結(jié)果確定9個(gè)共有峰,并生成對(duì)照指紋圖譜(R),見圖2。通過與對(duì)照指紋圖譜比較,計(jì)算各批次樣品的相似度(見表2);以芍藥苷峰為參照峰,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積(見表3、表4)。由表中數(shù)據(jù)可見,S1~S12號(hào)樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均大于0.90,表明12批不同樣品具有良好的相似性。

        表2 12批女金片指紋圖譜相似度

        表3 12批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

        表4 12批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

        圖2 12批女金片的指紋圖譜

        2.4.2 共有峰的歸屬 取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液,按擬定色譜條件進(jìn)樣,得到色譜圖(見圖1)。通過比較樣品和混合對(duì)照品指紋圖譜中共有峰的保留時(shí)間及紫外吸收光譜對(duì)共有峰進(jìn)行歸屬,確認(rèn)其中4號(hào)峰為芍藥苷,6號(hào)峰為橙皮苷,7號(hào)峰為黃芩苷。

        2.4.3 聚類分析 以3個(gè)廠家12批樣品9個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為變量,采用SPSS 22.0軟件,以組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法及歐氏距離平方為測度對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,結(jié)果見圖3。由圖3可見聚類趨勢,當(dāng)類間距為5時(shí),12批樣品被聚為三大類:S1、S2、S3、S4聚為一類,S5、S6、S7、S8、S9聚為一類,S10、S11、S12聚為一類。每一類均為同一廠家產(chǎn)品,表明同一廠家產(chǎn)品質(zhì)量具有較高的穩(wěn)定性。

        圖3 12批樣品聚類分析樹狀圖

        3 討論

        3.1 檢測波長選擇

        中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜,不同成分在不同波長下有最大吸收。文獻(xiàn)采用230 nm測定女金片中芍藥苷的含量[5],橙皮苷和黃芩苷的含量時(shí)選用280 nm[6-7]。本試驗(yàn)中采用DAD檢測器在200~800 nm波長對(duì)樣品進(jìn)行了全波長檢測,結(jié)合文獻(xiàn)[11-12],比較不同波長下的圖譜。結(jié)果表明,230 nm波長處得到的色譜峰數(shù)目較多,信息較為全面,故選擇230 nm作為檢測波長。

        3.2 供試品溶液的制備

        本試驗(yàn)對(duì)供試品提取溶劑的種類(甲醇、稀乙醇)、提取方法(超聲、回流)和提取時(shí)間(15,30,60 min)進(jìn)行考察。結(jié)果表明,甲醇提取效率低,部分共有峰分離度不符合要求;超聲提取和回流提取的提取率無明顯差異,但超聲操作簡便,用時(shí)較短,故選擇稀乙醇超聲作為供試品溶液的制備方法。

        3.3 指紋圖譜分析

        本試驗(yàn)建立了女金片的指紋圖譜共識(shí)別出9個(gè)共有峰,克服了單一化學(xué)成分作為質(zhì)控指標(biāo)的難題,較好地反應(yīng)了該制劑的內(nèi)在質(zhì)量信息,為女金片的總體研究提供了理論參考依據(jù)。但本制劑藥味眾多,未能確認(rèn)出每個(gè)共有峰的歸屬,因此,需要進(jìn)一步完善該指紋圖譜中共有峰的確認(rèn),為女金片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供更多的數(shù)據(jù)支撐。

        3.4 聚類分析

        12批女金片的指紋圖譜具有相同的色譜特征峰,但各色譜特征峰峰面積的相對(duì)比值有所差異。文獻(xiàn)表明,原料藥材來源及藥材質(zhì)量均會(huì)影響色譜峰峰面積,提示各廠家在選擇藥材投料生產(chǎn)前應(yīng)注意藥材成分含量的檢測。

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