李筱玲，何長(zhǎng)安，高珂欣，鄧寒霜，張 飛

（1. 商洛學(xué)院，陜西 商洛 726000；2. 陜西天士力植物藥業(yè)有限責(zé)任公司，陜西 商洛 726000）

決明子為豆科植物鈍葉決明Cassia obtusifolia L.或決明（小決明）Cassia tora L.的干燥成熟種子[1]。其性微寒，味苦、甘、咸，入肝、腎、大腸經(jīng)；是我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)常用中草藥，具有潤(rùn)腸通便，清肝明目的功效[2]。決明子為藥食兩用藥，有效成分主要為蒽醌類化合物[3]。其中所含游離蒽醌及結(jié)合蒽醌均具有降血脂、降血壓、抗氧化、保肝等作用，臨床應(yīng)用廣泛[4-5]。其內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)多以橙黃決明素、大黃酚為指標(biāo)，2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定決明子含大黃酚（C15H10O4）不得少于0.20 %，含橙黃決明素（C17H14O7）不得少于0.080 %，其含量測(cè)定方法多用HPLC法[6-8]。長(zhǎng)期或大劑量服用決明子會(huì)引發(fā)一定的肝腎毒性，其毒性與結(jié)合蒽醌的含量相關(guān)，結(jié)合蒽醌含量越低，毒性越低[9]。目前決明子的臨床應(yīng)用飲片主要有兩種，即生決明子和炒決明子。古人用“以苦酒漬經(jīng)三日暴干”的炮制方法炮制決明子，現(xiàn)代研究結(jié)果也表明醋制決明子后，游離蒽醌的含量顯著提高，是生品的4倍，是清炒品的近2倍[10]。因?yàn)闆Q明子中很多蒽醌類成分是以結(jié)合蒽醌形式存在，醋制的過(guò)程引入了醋酸，而結(jié)合蒽醌對(duì)醋酸敏感，使其水解轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x蒽醌；加之炮制過(guò)程受熱影響，濕熱條件下，結(jié)合蒽醌也可能被酶解，游離蒽醌含量增加。因此，對(duì)決明子醋制工藝進(jìn)行研究非常有必要，可確保決明子的用藥安全性。同時(shí)醋制引藥入肝，可提高決明子清肝明目的作用，增強(qiáng)其功效。本文以橙黃決明素、大黃酚2種成分的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)法，對(duì)影響醋制決明子品質(zhì)的加醋量、悶潤(rùn)時(shí)間、烘制溫度、烘制時(shí)間等4個(gè)因素水平進(jìn)行了考察，以期為決明子飲片的炮制工藝研究提供一定的幫助。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent HP1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；KQ5200DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ML204萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；750T型多功能粉碎機(jī)（鉑歐五金廠）；UV-2082 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)[尤尼柯（上海）儀器有限公司]。

1.2 試藥

決明子，購(gòu)自陜西省商洛市香菊大藥房（寧縣康盛園藥業(yè)有限在責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：Y18110803）；9度純釀米醋（佛山市海天調(diào)味食品股份有限責(zé)任公司）；乙腈[色譜純，利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司]；三氯甲烷、乙醇等（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：171118）、橙黃決明素對(duì)照品（批號(hào)：171218），由北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司提供，純度均大于99 %。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 取大黃酚對(duì)照品、橙黃決明素對(duì)照品適量，精密稱定，加無(wú)水乙醇-乙酸乙酯（2:1）混合溶液制備混合對(duì)照品，得2種對(duì)照品實(shí)際濃度分別為35.2，23.3 μg/ml 。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 ml蒸干，加稀鹽酸30 ml，置水浴中加熱水解1 h，立即冷卻，用三氯甲烷振搖提取4次，每次30 ml，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇-乙酸乙酯（2:1）混合溶液使溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。2.1.3 色譜條件 Hypersil Gold C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈作為流動(dòng)相A，0.1 %磷酸溶液作為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm，柱溫30 ℃，流速1 ml/min；理論塔板數(shù)按橙黃決明素峰計(jì)不低于3000。在此色譜條件下，樣品中各色譜峰分離度均可達(dá)到1.5以上。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.1.4 樣品測(cè)定 取各試驗(yàn)處理所得決明子樣品適量，照“2.1.2”項(xiàng)中方法制備供試品溶液，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，精密吸取濾液10 μl進(jìn)樣，照“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖，計(jì)算橙黃決明素和大黃酚的含量。

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

2.2.1 專屬性試驗(yàn) 照“2.1.1”項(xiàng)方法分別制備橙黃決明素、大黃酚單一對(duì)照品和陰性對(duì)照溶液；照“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各樣品中橙黃決明素、大黃酚的保留時(shí)間與對(duì)照品一致，2個(gè)對(duì)照品色譜峰的理論塔板數(shù)均在9000以上，單對(duì)照品及陰性對(duì)照色譜圖均顯示，無(wú)其他雜質(zhì)組分干擾含量測(cè)定結(jié)果。各組分色譜圖見(jiàn)圖1 。

圖1 各成分HPLC色譜圖

2.2.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2，4，8，10，16，20 μl對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，照“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行分析。以濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。得橙黃決明素的線性回歸方程是Y=45 717X+239.42，R2=0.9998；大黃酚的線性回歸方程是Y=19 041X+9371.8，R2=0.9998。橙黃決明素在濃度為4.66～46.6 μg/ml之間具有良好線性關(guān)系，大黃酚在濃度為7.04～70.4 μg/ml之間具有良好線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取大黃酚、橙黃決明素混合對(duì)照品溶液10 μl，照“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行HPLC分析，連續(xù)進(jìn)樣5次。以大黃酚、橙黃決明素色譜峰面積計(jì)算RSD，分別為1.27 %，1.16 %，表明儀器具有良好的精密度。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一決明子樣品，照“2.1.2”項(xiàng)方法，平行處理5份供試品溶液，照“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行HPLC分析。以大黃酚、橙黃決明素色譜峰面積計(jì)算RSD，分別為1.57 %，2.34 %，表明所用供試品制備方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，照“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行HPLC分析，每間隔0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣，以大黃酚、橙黃決明素色譜峰面積計(jì)算RSD，分別為1.28 %，0.95 %，表明供試品溶液在12 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的醋制決明子樣品9份，每份0.5 g，精密稱定重量，平均分成3組，按低、中、高濃度分別加入混合對(duì)照溶液，每組3個(gè)重復(fù)，按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，照“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明橙黃決明素、大黃酚平均回收率分別為99.2 %，99.6 %，RSD分別為1.78 %，1.34 %，說(shuō)明所用檢測(cè)方法具有良好的準(zhǔn)確性。

2.3 單因素試驗(yàn)

以加醋量、悶潤(rùn)時(shí)間、烘制時(shí)間、烘制溫度4個(gè)因素為考察對(duì)象，每因素設(shè)5個(gè)不同水平，以橙黃決明素、大黃酚含量進(jìn)行綜合評(píng)分。綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為，橙黃決明素含量權(quán)重60分，大黃酚含量權(quán)重40分。計(jì)算公式如下：

綜合評(píng)分=橙黃決明素含量×60+大黃酚含量×40

2.3.1 加醋量的影響 取10份同批決明子樣品，等分為5組，分別加入樣品量10 %，20 %，30 %，40 %，50 %的米醋，其他條件固定為，悶潤(rùn)時(shí)間1 h、烘制溫度60 ℃、烘制時(shí)間3 h，每組2個(gè)重復(fù)，考察加醋量對(duì)醋制決明子質(zhì)量的影響，結(jié)果表明加醋量為30 %為最佳。

2.3.2 悶潤(rùn)時(shí)間的影響 取10份同批決明子樣品，等分為5組，分別悶潤(rùn)1，2，3，4，5 h，其他條件固定為，加醋量30 %、烘制溫度60 ℃、烘制時(shí)間3 h，每組2個(gè)重復(fù)，考察悶潤(rùn)時(shí)間對(duì)醋制決明子質(zhì)量的影響，結(jié)果表明悶潤(rùn)3 h為最佳。

2.3.3 烘制溫度的影響 取10份同批決明子樣品，等分為5組，分別在40，50，60，70，80 ℃下烘制，其他條件固定為，加醋量30 %、悶潤(rùn)時(shí)間3 h、烘制時(shí)間3 h，每組2個(gè)重復(fù)，考察烘制溫度對(duì)醋制決明子質(zhì)量的影響，結(jié)果表明在80℃下烘制為最佳。

2.3.4 烘制時(shí)間的影響 取10份同批決明子樣品，等分為5組，分別烘制1，2，3，4，5 h，其他條件固定為，加醋量30 %、悶潤(rùn)時(shí)間3 h、烘制溫度80℃，每組2個(gè)重復(fù)，考察烘制時(shí)間對(duì)醋制決明子質(zhì)量的影響，結(jié)果表明烘制4 h為最佳。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

取單因素試驗(yàn)所得優(yōu)水平為中間水平，分別對(duì)加醋量（A）、悶潤(rùn)時(shí)間（B）、烘制溫度（C）、烘制時(shí)間（D）進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，評(píng)價(jià)辦法與單因素試驗(yàn)相同。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)置見(jiàn)表2，每個(gè)試驗(yàn)條件平行處理2份樣品，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表2 決明子醋制工藝正交試驗(yàn)因素水平設(shè)置

表3 決明子醋制工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

由表3、表4可見(jiàn)，各因素對(duì)醋制決明子品質(zhì)影響大小順序?yàn)锳（加醋量）>C（烘制溫度）>D（烘制時(shí)間）>B（悶潤(rùn)時(shí)間），其中加醋量與烘制溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。由結(jié)果可見(jiàn)，醋制決明子的最佳炮制工藝條件為A2B3C2D3。即加醋量30 %、悶潤(rùn)4 h、烘制溫度80 ℃、烘制5 h。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

因優(yōu)選出的最佳處理?xiàng)l件并未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)中，為確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，本文對(duì)最優(yōu)工藝進(jìn)行了驗(yàn)證。具體方法如下，稱取同批決明子藥材3份，每份50 g，分別加入15 ml米醋，拌勻，悶潤(rùn)4 h后，在80 ℃下烘制5 h。照前述方法檢測(cè)得橙黃決明素、大黃酚含量平均值分別為0.183 %、0.341 %，平均綜合評(píng)分為24.62（RSD為1.9 %），高于全部9個(gè)正交試驗(yàn)處理，表明所優(yōu)選出的最優(yōu)工藝條件真實(shí)可信、重復(fù)性好，可為決明子飲片炮制生產(chǎn)實(shí)際提供參考。

3 結(jié)論與討論

決明子有效成分主要為蒽醌類物質(zhì)。其中，結(jié)合蒽醌是瀉下主要成分，有一定毒性；游離蒽醌為抗菌主要成分，并有降血脂、降血壓、抗氧化等作用。橙黃決明素、大黃酚均為游離蒽醌，是決明子降脂主要成分，因此以橙黃決明素、大黃酚的含量為決明子飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，具有一定的合理性，有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。

決明子有醋制、炒制（清炒、鹽炒）和酒制等炮制規(guī)格，不同的炮制方法、炮制工藝條件對(duì)決明子中有效成分的含量有很大的影響。目前有關(guān)決明子炮制方法的研究主要集中在清炒品方面，對(duì)決明子其他傳統(tǒng)炮制方法的報(bào)道甚少，特別是關(guān)于醋制決明子的工藝研究未見(jiàn)有報(bào)道。

本課題組在前期研究中，采用醋炙、醋蒸、醋煮、醋烘、醋悶等不同方法對(duì)決明子進(jìn)行了炮制，發(fā)現(xiàn)醋烘法所得飲片中總蒽醌的含量為0.680 %（以1,8-二羥基蒽醌為對(duì)照品，用0.6 %醋酸鎂甲醇溶液顯色，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法在520 nm檢測(cè)），是5種方法中僅次于醋蒸法（0.687 %）的，接近于生品（0.742 %）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，醋烘法所得飲片的橙黃決明素含量最高為0.15 %，大黃酚為0.27 %，也高于生品（0.13 %，0.26 %）?？紤]到醋烘法相較于醋蒸法，可簡(jiǎn)化操作環(huán)節(jié)，提高工作效率，有利于大規(guī)模生產(chǎn)，故本文對(duì)以烘法炮制醋決明子的最佳工藝進(jìn)行了研究，最終確定醋制決明子的最優(yōu)炮制藝條件為：加醋量30 %，悶潤(rùn)時(shí)間4 h，烘干溫度80℃，烘干時(shí)間為5 h。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，在此最優(yōu)條件下炮制所得醋制決明子中橙黃決明素和大黃酚含量平均值分別為0.183 %，0.341 %，較之前工藝所得飲片含量有明顯增加，表明本研究成果具有一定的應(yīng)用價(jià)值。