孫 菲， 蘇維瑋， 付艷華， 王經(jīng)偉

山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島) 肝病科， 山東 青島 266035

肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)病率高、預(yù)后差，是全球范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。早期肝癌以手術(shù)切除為主，中晚期肝癌主要治療方式包括局部消融、經(jīng)肝動脈栓塞化療、免疫及靶向治療等，但總體治療效果欠佳，我國肝癌患者5年存活率僅12.1%[1]。因此進(jìn)一步研究原發(fā)性肝癌發(fā)病機制及尋找新的治療靶點顯得十分重要。Krüppel樣因子(Krüppel-like factors，KLFs)為鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子，目前，已鑒定包含17個人類KLFs成員。KLF4是KLFs家族重要成員之一，屬于C2H2型鋅指蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞周期、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞增殖、凋亡，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育及調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等過程中發(fā)揮重要作用。目前，KLF4已被證實在HCC中表達(dá)下降，進(jìn)一步研究證實上調(diào)KLF4可以抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲[2]。相關(guān)研究[3-5]證明，KLF4在肝癌中參與調(diào)節(jié)Notch通路、Wnt/β-catenin等多個信號通路，與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其中的具體調(diào)控機制仍未完全明確，本文將從KLF4的結(jié)構(gòu)、功能以及在肝癌中發(fā)揮的作用進(jìn)行綜述。

1 KLF4的結(jié)構(gòu)特點與功能

人KLF4基因位于染色體9q31，編碼的KLF4蛋白含470個氨基酸殘基，分子量約55 kDa。小鼠的KLF4基因定位于染色體4B3，編碼含483個氨基酸殘基的多肽，與人類KLF4氨基酸序列相比，同源性為91%。KLF4蛋白含有2個核定位信號，分別位于鋅指結(jié)構(gòu)的N-端及前方，二者都能單獨將KLF4蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。KLF4蛋白具備3個主要功能結(jié)構(gòu)域[6]：羧基端DNA結(jié)合域、氨基端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域、鋅指結(jié)構(gòu)核定位序列。KLF4羧基端序列高度保守，包含3個連續(xù)的Cys2-His2鋅指結(jié)構(gòu)，發(fā)揮特異性結(jié)合DNA的作用；氨基端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域序列高度變異，其中轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸和絲氨酸，位于91～117位氨基酸殘基處；轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸，位于第181～371氨基酸殘基處。同時具備激活域和抑制域使得KLF4對下游靶基因具有活化和抑制雙重調(diào)控作用[7]。

KLF4介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄通過磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化等多種方式進(jìn)行翻譯后修飾。這些修飾通過改變KLF4的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄活性來調(diào)控其功能[8]。KLF4第225及229位賴氨酸殘基受p300/CBP復(fù)合物調(diào)節(jié)，發(fā)生乙?；揎椇笸蛔?yōu)榫彼?，KLF4活性受到抑制[9]，進(jìn)而削弱其反式激活靶基因的能力。而抑制組蛋白乙酰化和精氨酸甲基化能夠協(xié)同作用激活KLF4表達(dá)。研究[10]表明，磷酸化ERK1和ERK2可抑制KLF4活性，同時可將F-box蛋白βTrCP1或βTrCP2聚集到KLF4的N端結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而導(dǎo)致KLF4的泛素化和降解，同時促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化。Yang等[11]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞中KLF4啟動子CpG島高甲基化狀態(tài)誘導(dǎo)KLF4失活，抑制其腫瘤抑制因子功能。由此可見，KLF4介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄受多種方式調(diào)節(jié)修飾。

KLF4高表達(dá)于胃腸道上皮細(xì)胞，在角膜、血管內(nèi)皮、睪丸組織、胸腺細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞也有不同程度的表達(dá)。研究[12]表明，KLF4參與調(diào)控細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、胚胎發(fā)育等生命過程，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。KLF4同時具備轉(zhuǎn)錄激活域和轉(zhuǎn)錄抑制域，因此KLF4在不同腫瘤發(fā)展過程中可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮不同功效，可作為腫瘤治療的分子靶點。KLF4作為抑癌基因還是癌基因發(fā)揮作用，受細(xì)胞分化差異、細(xì)胞核基因表達(dá)狀態(tài)以及細(xì)胞染色質(zhì)環(huán)境等因素調(diào)節(jié)，具體機制尚待進(jìn)一步探究。研究表明, KLF4在胃癌[13]、食管癌[14]、結(jié)腸癌[15]、胰腺癌[16]等多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。相反，KLF4在皮膚鱗癌、喉癌等腫瘤中發(fā)揮促癌作用。Lin等[17]研究發(fā)現(xiàn)KLF4在HCC中呈現(xiàn)低表達(dá)， 增加KLF4表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)EMT過程并促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，肝癌患者中低表達(dá)KLF4者預(yù)后相對更差，更易發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及肝外轉(zhuǎn)移。

2 KLF4與肝癌細(xì)胞增殖

KLF4不僅是正常細(xì)胞增殖的重要調(diào)控因子，也能夠調(diào)控各種腫瘤細(xì)胞的生長增殖。相關(guān)研究表明肝癌組織和細(xì)胞中KLF4表達(dá)明顯下調(diào)或缺失，KLF4對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用[18-19]，提示肝癌中KLF4是一個抑癌基因。KLF4對于抑制肝癌細(xì)胞增殖與阻滯細(xì)胞周期有關(guān)。KLF4通過作用于p21CIP1/WAF1基因啟動子中富含GC的特異性順式作用元件，反式激活p21CIP1/WAF1等細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，抑制細(xì)胞周期蛋白cyclinB1及cyclinD1的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯于G1/S期或者G2/M期，進(jìn)而抑制腫瘤增殖[20]。KLF4還可以上調(diào)細(xì)胞周期抑制蛋白CDKN1A的表達(dá)，KLF4通過結(jié)合特異性SP1樣順式元件來激活CDKN1A啟動子，同時聚集p53到CDKN1A啟動子區(qū)域，進(jìn)而激活CDKN1A基因的轉(zhuǎn)錄。CDKN1A在多種腫瘤中可抑制細(xì)胞生長增殖，通過抑制G1期向S期進(jìn)展負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期。CDKN1A還可激活p21CIP1/WAF1并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而p21CIP1/WAF1激活是p53、APC及TGFβ等腫瘤抑制信號通路激活的核心環(huán)節(jié)。研究[21]表明KLF4可以上調(diào)P-cadherin的表達(dá)，而P-cadherin在肝癌中通過調(diào)節(jié)GSK-3β抑制腫瘤生長增殖。Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，KLF4甲基化修飾后表達(dá)沉默，導(dǎo)致其下游靶基因維生素D3受體與維生素D3作用減弱，抑制后者抗增殖效應(yīng)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及侵襲。而上調(diào)KLF4表達(dá)能明顯抑制裸鼠移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移，提示KLF4可作為肝癌基因治療的新靶點。相關(guān)研究[23]發(fā)現(xiàn)肝癌中KLF4上調(diào)CD9和CD81的表達(dá)，后者通過負(fù)向調(diào)節(jié)MAPK/JNK信號通路來抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮腫瘤抑制作用。以上研究表明，KLF4在肝癌中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖的作用。

3 KLF4與肝癌細(xì)胞EMT及轉(zhuǎn)移侵襲

EMT涉及各種實體腫瘤發(fā)生侵襲前丟失上皮細(xì)胞特性和獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性，是癌變的中心步驟。獲得間充質(zhì)特性將這些細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤中釋放出來，使它們侵入鄰近的組織，進(jìn)入循環(huán)并轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處的器官。多種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控EMT激活和發(fā)展，如Snail-1/2、Zeb-1/2、Twist、TGFβ1等，KLF4也是其中之一，可直接抑制EMT關(guān)鍵基因的表達(dá)。在HCC中，KLF4通過調(diào)控ERK、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin等信號通路發(fā)揮作用，抑制EMT[24]。KLFs家族成員KLF11通過與Smad7啟動子結(jié)合而抑制其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT。而KLF4通過與KLF11啟動子結(jié)合，抑制其誘導(dǎo)的肝癌EMT過程[25]。同時，KLF4還可以通過與Smad7啟動子結(jié)合而上調(diào)其表達(dá)，通過這條途徑，抑制TGFβ信號傳導(dǎo)，因此，在HCC細(xì)胞中KLF4表達(dá)的缺失可能有助于致癌性TGFβ信號的激活和隨后的腫瘤進(jìn)展[26]。結(jié)腸癌中KLF4通過抑制TGFβ1/Smad信號傳導(dǎo)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞EMT進(jìn)展，降低其侵襲力[27]。Lin等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在HCC中，上調(diào)KLF4表達(dá)可以抑制其間充質(zhì)特性，使細(xì)胞形態(tài)向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，反之敲除KLF4則使細(xì)胞獲得間質(zhì)特性并促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。其機制可能是通過KLF4 特異性結(jié)合slug啟動子并抑制其活性，而上調(diào)slug表達(dá)可一定程度逆轉(zhuǎn)KLF4介導(dǎo)的細(xì)胞上皮樣表型。Liu等[28]研究表明，在前列腺癌中，KLF4可以抑制slug轉(zhuǎn)錄表達(dá)，KLF4缺失促進(jìn)slug依賴的EMT發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。以上研究表明，KLF4對腫瘤EMT過程發(fā)揮抑制作用，進(jìn)而降低腫瘤的遷移、侵襲能力，抑制腫瘤進(jìn)一步惡性進(jìn)展。

研究[29]表明，KLF4表達(dá)缺失的腫瘤細(xì)胞更具侵襲性，肺癌細(xì)胞中上調(diào)KLF4表達(dá)可以增加CDH1的表達(dá)，并抑制SNAI2、TWIST1和Vimentin的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的遷移和入侵。在順鉑耐藥鼻咽癌細(xì)胞中，KLF4通過抑制NOTCH1表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞遷移侵襲[30]。在HCC中，KLF4通過與miRNA相互作用，抑制SNAI1、SNAI2和ZEB1表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞遷移侵襲[31]。He等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在HCC中，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子7(TRAF7)作為一種E3-泛素連接酶，通過將KLF4泛素化和降解進(jìn)而促進(jìn)HCC的遷移和侵襲。研究[33]表明肝癌中KLF4的轉(zhuǎn)錄活性被DDX17負(fù)性調(diào)節(jié)，后者在肝癌中促進(jìn)腫瘤增殖轉(zhuǎn)移。KLF4還可以上調(diào)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP)-1、TIMP-2表達(dá)，后者參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解，進(jìn)而降低肝癌細(xì)胞侵襲力[34]。Yang等[35]及Rajasekaran等[36]研究發(fā)現(xiàn)，單酰甘油酯酶(monoacylglycerol lipase，MGLL)在肝癌中低表達(dá)，是肝癌中KLF4作用的靶基因之一。MGLL低表達(dá)的患者5年生存率降低，MGLL過表達(dá)抑制HCC細(xì)胞遷移侵襲，KLF4與MGLL啟動子結(jié)合并上調(diào)HCC細(xì)胞中MGLL的表達(dá)。與周圍的非腫瘤組織相比，HCC中KLF4的表達(dá)降低，并且與腫瘤數(shù)量、分化等級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，低KLF4表達(dá)可能意味著HCC患者的預(yù)后較差[37]。

4 KLF4與肝癌凋亡

KLF4基因不僅影響細(xì)胞增殖、分化，而且與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。KLF4在黑色素瘤通過減少腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞的生長，發(fā)揮促癌作用[38]。研究[39-40]表明KLF4激活可以導(dǎo)致p53上調(diào)和抑制Bcl-xL的表達(dá), 通過凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。KLF4可以調(diào)節(jié)p53啟動子的轉(zhuǎn)錄，而p53可以調(diào)節(jié)KLF4的表達(dá),KLF4和p53之間的反饋回路可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。凋亡過程的另一個重要調(diào)節(jié)劑是caspase家族，在Bax作用下，細(xì)胞線粒體滲透性增加，導(dǎo)致caspase3和caspase7激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。激活Bax轉(zhuǎn)錄是KLF4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑之一[41]。BIK通過與Bcl-2及Bcl-xL公共BH3結(jié)構(gòu)域直接作用，抑制其抗細(xì)胞凋亡功能，并以Bax依賴的方式引起細(xì)胞凋亡，Zhang等[42]證明KLF4是順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)劑，他們發(fā)現(xiàn)KLF4上調(diào)了前列腺癌細(xì)胞中BIK的表達(dá)，并促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的BIK的表達(dá)。在不同腫瘤中，KLF4可以反過來發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的功能。KLF4在高達(dá)70%的人類乳腺癌中過表達(dá)，而KLF4的核定位與侵襲性表型相關(guān)，乳腺癌中KLF4通過直接作用于p53啟動子中的PE21元件來抑制p53的表達(dá),在此背景下，KLF4抑制DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。以上KLF4在HCC中的作用見圖1。

注:KLF4的表達(dá)受到DNA甲基化、microRNA、DNA損傷等因素調(diào)節(jié)。KLF4調(diào)控的下游靶基因介導(dǎo)了KLF4在肝癌細(xì)胞中的抑制作用。

5 小結(jié)

目前，臨床上治療肝癌的方案較多，但多數(shù)患者治療效果欠佳、預(yù)后較差。了解KLF4在肝癌中的作用有助于人們進(jìn)一步明確肝癌發(fā)生發(fā)展機制，并為肝癌治療提供新的思路。KLF4作為鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族中重要成員，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要的作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，KLF4在多數(shù)乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤中發(fā)揮促癌作用；而在胃癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。KLF4在HCC中低表達(dá)，增加KLF4表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移侵襲，關(guān)于KLF4在肝癌中具體作用機制尚需進(jìn)一步研究，KLF4不僅可能成為肝癌有價值的預(yù)后生物標(biāo)志物，也可能成為肝癌的治療靶點[43]，為肝癌的分子靶向治療和預(yù)后監(jiān)測提供新思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：孫菲負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；蘇維瑋、付艷華參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；王經(jīng)偉負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。