錢南南， 唐露露， 魏濤華,， 楊 悅， 郝文杰， 楊文明,3

1 安徽中醫(yī)藥大學 研究生院， 合肥 230038； 2 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 神經內科， 合肥 230031；3 新安醫(yī)學教育部重點實驗室， 合肥 230038

肝纖維化是由多種病因(如血吸蟲、慢性病毒性肝炎感染、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、銅代謝性疾病、膽汁淤積和自身免疫性肝病)引起的慢性肝損傷，可逐漸發(fā)展為肝硬化，甚至引起肝癌的發(fā)生。近些年研究發(fā)現，肝纖維化是一個可逆轉的過程，給肝纖維化的臨床治療帶來了希望。肝纖維化發(fā)展過程中主要是由肝星狀細胞(HSC)活化為成纖維細胞，并分泌細胞外基質(ECM)。因此，控制HSC的活化過程將是肝纖維化的理想治療策略。大量研究表明，非編碼RNA(ncRNA)對HSC活化、增殖、遷移、轉化等過程起著重要作用。ncRNA主要包括長鏈非編碼RNA(lncRNA)、短鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA(circRNA)等幾大類，其中與肝纖維化相關的主要有：lncRNA包括MALAT1、H19、GAS5、MEG3、PVT1和P21等；短鏈非編碼RNA包括微小RNA(miRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、PIWI-interacting RNA(piRNA)和小干擾RNA(siRNA)等。細胞外囊泡包括外泌體、微囊泡和凋亡小體，外泌體是由大小為30～100 nm的膜囊泡構成。外泌體可以由各種動物的大部分細胞所分泌。在正常和病理情況下，外泌體參與眾多的生物學過程。有證據[1]表明，外泌體內含有蛋白質、脂質、DNA和各種形式的RNA(例如miRNA、lncRNA等)?，F就外泌體ncRNA在肝纖維化中的作用進行深入探析，以期為肝纖維化治療藥物尋找潛在新靶點。

1 外泌體lncRNA與肝纖維化

1.1 外泌體MALAT1 MALAT1基因位于人染色體11q13和小鼠染色體19qA內。MALAT1與許多蛋白質編碼基因(如β-肌動蛋白，GAPDH)相當甚至具有更高的表達水平。MALAT1基因在人類中約為7 kb。先前有研究[2]發(fā)現，MALAT1可與miR-101b競爭來調節(jié)rac1的表達，影響HSC的增殖、細胞周期和激活，從而增加ECM的沉積。此外，MALAT1也可能通過介導SIRT1的下調，來活化肝星狀細胞系LX-2細胞，導致肝纖維化的形成[3]。而Dai等[4]研究發(fā)現，使用砷酸鹽可誘導肝細胞系L-02細胞MALAT1的過表達，并且MALAT1可以通過外泌體轉運到LX-2細胞中，并認為MALAT1可通過miR-26b調節(jié)Ⅰ型膠原蛋白A2促進LX-2細胞的激活。由此可見，MALAT1可通過多種方式導致肝纖維化的形成。因此，外泌體中MALAT1可作為肝纖維化逆轉的一個潛在靶點。

1.2 外泌體H19 H19是一種lncRNA，受H19和IGF2之間的位點甲基化的基因組印跡調控，越來越多的研究表明，H19具有許多不同的生物學功能。包括參與細胞增殖和分化，以及其在癌癥中作為癌基因角色和腫瘤抑制劑等。H19主要在膽管細胞中表達，其能通過外泌體轉移至肝細胞中顯著下調小分子異二聚體伴侶的表達、調節(jié)S1PR2/SphK2和LET-7/HMGA2介導的途徑、增加G1/S細胞周期轉變促進HSC的增殖和激活等途徑進而在調節(jié)膽管細胞增殖和促進肝纖維化方面發(fā)揮重要作用[5]。此外H19還可以作為miRNAs的分子海綿(如let-7 miRNAs)，在膽汁性肝硬化的發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

1.3 外泌體GAS5 GAS5 RNA基因位于細胞遺傳學帶1q25.1，GAS5基因有31個轉錄本，其中20個為保守的內含子，而11個為lncRNA。GAS5可以結合DNA結合結構域，從而使其無法調節(jié)靶基因的轉錄。GAS5可通過充當miR-222的競爭內源RNA(ceRNA)而增加p27蛋白的水平，從而抑制HSC的活化和增殖[6]。GAS5可作為miR-23a的分子海綿，從而競爭性地降低miR-23a的表達水平。miR-23a與PTEN的相互作用以及PTEN的降解進一步影響了下游信號通路PI3K/Akt/mTOR/ Snail，導致E-鈣黏蛋白表達水平降低和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白的表達水平增加，從而導致肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[7]。據報道[8]，外泌體GAS5的上調參與細胞凋亡過程，另外，有研究[9]表明，GAS5可通過外泌體途徑調節(jié)巨噬細胞和內皮細胞的凋亡，來發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。作為細胞外囊泡，外泌體在細胞間通訊中至關重要，并且可能是GAS5的關鍵載體[10]，因此，推測GAS5亦可通過外泌體途徑影響上述通路發(fā)揮抗纖維化作用。

1.4 外泌體MEG3 MEG3基因位于人染色體14q32.3區(qū)域的印跡DLK1-MEG3基因座上。MEG3在正常組織中表達，但在許多人類腫瘤和腫瘤衍生細胞系中丟失或減少。近些年已有研究[11-13]表明，含有MEG3的外泌體在腫瘤積液、宮頸陰道灌洗液、尿液中檢測到，并在宮頸癌、高度漿液性癌和Hunner型間質性膀胱炎中起到作用。而關于肝纖維化的外泌體MEG3暫未有相關報道。有報道[14]指出，MEG3的過表達可激活p53并介導細胞色素c的釋放，隨后導致TGFβ1處理的LX-2細胞發(fā)生caspase-3依賴性的凋亡。這些發(fā)現表明，MEG3可能在HSC活化和肝纖維化進展中起重要作用，并作為肝纖維化的新型潛在治療靶標。此外，MEG3亦可通過SMO蛋白和miR-212抑制Hh信號通路介導的肝纖維化上皮-間充質轉化過程[15]。由此，預測MEG3可通過外泌體途徑發(fā)揮抗肝纖維化作用，但還需要進一步研究。

1.5 外泌體PVT1 PVT1是一類lncRNA，人PVT1基因位于8q24，這是公認的與癌癥相關的區(qū)域。PVT1已被證明與肝纖維化相關。有研究[16]表明，通過PVT1-miR-152-ATG14信號通路的自噬誘導有助于缺氧條件下HSC的激活。目前還未有外泌體PVT1在肝纖維化中的相關研究。但是，Meng等[17]報道外泌體介導的PVT1通過miR-93-5p調節(jié)的HMGB1/TLR4/NF-κB通路來調節(jié)脂多糖(LPS)誘導的骨關節(jié)炎進展。Wu等[18]通過實驗發(fā)現，M2巨噬細胞來源的外泌體攜帶的lncRNA PVT1共同作用于miR-21-5p，以上調SOCS5并使JAKs/STAT3途徑失活，從而減少炎癥并保護自身免疫性腦脊髓炎小鼠。由此，將外泌體PVT1擴展在肝纖維化中，預測亦可發(fā)揮相應作用。

1.6 外泌體P21 P21基因位于人類染色體6p21.2上，位于細胞周期調控基因p21/Cdkn1a的上游，首次被描述為小鼠胚胎成纖維細胞p53依賴性凋亡的誘導劑。P21有兩種亞型，它們都包含一個外顯子和Alu反向重復序列。據報道[19]，P21在HBV感染者血清中的水平低于健康對照者，且血清P21水平與感染者的肝纖維化階段呈負相關。Zheng等[20]研究發(fā)現，P21的過度表達在體外抑制HSC的激活。慢病毒介導的P21轉移至小鼠體內可降低肝纖維化的嚴重程度。Tu等[21]發(fā)現P21作為TGFβ信號的下游效應，通過與miR-30相互作用來增強TGFβ信號并介導其促進肝纖維化的作用。有報道[22]，在非小細胞肺癌患者引流靜脈血液及前列腺癌尿液中檢測到含有P21的外泌體。肝纖維化有關外泌體P21尚未有文獻報道，有待進一步研究。

2 外泌體短鏈非編碼RNA與肝纖維化

2.1 外泌體miRNA miRNA是一種由22個左右的核苷酸構成的短鏈非編碼RNA。通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)結合參與轉錄后基因調控，影響多種細胞過程，包括細胞分化、能量代謝和代謝應激。根據近些年報道，與肝纖維化相關的miRNA有近百種，如能促進肝纖維化的有miR-200c[23]、miR-942[24]、miR-302c[25]、miR-182[26]、miR-195[27]等；具有抗肝纖維化作用的包括miR-30/miR-193[28]、miR-30[29]及miR-326[30]。有趣的是，一些研究發(fā)現miR-21[31-32]和miR-145[33-34]具有相反作用，既有促進肝纖維化又具有抗纖維化作用，因此具體的機制有待進一步研究。在外泌體miRNA相關研究[35]中發(fā)現，肝硬化肝癌患者血清和腹水中外泌體miR-182、miR-301a和miR-373的表達水平顯著增加。有研究[36]表明，miR-122和miR-214可通過外泌體介導抑制HSC的活化，從而達到抗纖維化的作用。此外，miR-181-5p則可通過外泌體介導抑制STAT3/Bcl-2-Beclin 1途徑來增加自噬并減少TGFβ1誘導的肝纖維化[37]。又有報道[38]，miR-199a-5p可通過外泌體作用于結締組織生長因子(CCN2)，導致CCN2及其下游靶標α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白α1的表達降低，從而發(fā)揮抗纖維化的作用。miR-223通過外泌體途徑調控NLRP3和caspase-1發(fā)揮保肝作用[39]，而miR-103-3p可通過外泌體介導靶向Krüppel樣因子4(KLF4)促進HSC的增殖和激活[40]。外泌體miRNA與肝纖維化的關系總結詳見表1。

2.2 外泌體snoRNA snoRNA是一類保守的核RNA家族，在核糖體亞單位成熟過程中參與小核RNA(snRNA)或核糖體RNA(rRNA)的修飾或加工。snoRNA越來越多地被證實參與調控新類型的轉錄后過程，例如RNA乙?；?、剪接模式的調節(jié)、mRNA豐度的控制和翻譯效率，或者它們本身被加工成更短的穩(wěn)定的RNA種類。先前已證實，在肝硬化患者體內snoRNA包括SNORD115-31、SNORD37、SNORD121B被下調。一項研究[41]表明，LPS可以在小鼠模型、人類受試者及巨噬細胞培養(yǎng)基中刺激snoRNA U32a(SNORD32a)、U33(SNORD33)、U34(SNORD34)和U35a(SNORD35a)的分泌，分泌的snoRNA和外泌體共同體被受體細胞吸收。在鼠模型中，證明外泌體snoRNA通過循環(huán)并在遠端的組織中發(fā)揮功能。然而關于snoRNA在肝纖維化中的研究較少。有研究[42]表明，通過抑制SNHG7(一種snoRNA)可以抑制肝纖維化。進一步實驗表明，可能是SNHG7充當ceRNA，通過與miR-29b結合來影響DNMT3A(miR-29b的下游靶基因)的表達，從而影響HSC的活化、自噬和增殖。

2.3 外泌體piRNA piRNA是一類小RNA，長度為24～31個核苷酸。它們與PIWI蛋白締合，后者構成Argonaute家族的種系特異性亞群，形成稱為piRNA誘導的沉默復合物的效應物復合物，該復合物通過轉錄或轉錄后機制抑制轉座子并維持種系基因組完整性。除了在轉座子沉默中起作用外，多種生物中的piRNA還可以調控細胞基因。越來越多的證據表明，piRNA在癌癥發(fā)展中同時具有致癌作用和抑癌作用。但piRNA在肝纖維化中的作用研究較少。有研究[43]表明，激活的HSC中piR-823顯著上調，進一步實驗表明，活化的HSC可促進piR-823的合成，另一方面piR-823上調又可以促進HSC的活化。其機制可能為piR-823與EIF3B(真核起始因子3B)結合，并且該復合物進一步募集TGFβ1的mRNA并產生TGFβ1，TGFβ1激活靜止的HSC所致。先前已有相關報道[44]，在血清、腦脊髓液、尿液等體液中檢測到含有piRNA的外泌體。因此，在肝纖維化中的外泌體piRNA需要進一步研究。

2.4 外泌體siRNA siRNA是一種由21～23個堿基對構成的雙鏈RNA，包括兩個突出核苷酸的羥基化3′末端。與靶mRNA具有序列互補性的siRNA反義鏈可誘導序列特異性基因表達沉默，這被稱為RNA干擾(RNAi)。RNAi首先在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現，后來在植物、動物和人類細胞中發(fā)現。越來越多關于siRNA的研究，其中也涉及到治療肝纖維化，Toriyabe等[45]研究發(fā)現siRNA可抑制HSCⅠ型膠原蛋白α1、TGFβ、α-SMA的表達。Zhang等[46]用siRNA可干擾CTGF、TIMP-1、procol-α1、PCⅢ在肝組織中的蛋白表達水平。Ge等[47]則發(fā)現，GRB2 siRNA消除了HMGB1誘導的HSC增殖以及上調Ⅰ型膠原蛋白α1和α-SMA的作用。雖然越來越多關于siRNA的應用研究，但siRNA如何到達靶細胞發(fā)揮作用從而限制了siRNA發(fā)展

表1 外泌體miRNA與肝纖維化的關系

的機制仍不明確。目前除了常規(guī)局部及血清用藥，還有化學修飾、脂質體、病毒載體、納米顆粒等傳遞系統(tǒng)。近些年以外泌體為載體的研究越來越多應用于臨床中，如神經系統(tǒng)疾病、眼部疾病、肝臟疾病、腎臟疾病等。Pan等[48]發(fā)現從人肝癌細胞釋放的外泌體可以使siRNA在肝細胞之間穿梭，并抑制小鼠肝細胞中CD81的表達，這些結果使基于外泌體的siRNA在肝纖維化的治療領域得到進一步擴展。

3 外泌體circRNA與肝纖維化

circRNA是一種共價閉合環(huán)狀結構的RNA，沒有5′端和3′端之分，主要由前體mRNA通過外顯子的反向剪接形成。circRNA在肝病中有很多作用機制，包括microRNA海綿、蛋白質翻譯、RNA支架、mRNA制動等。有研究[49]表明，通過分析CCl4小鼠肝纖維化模型肝組織中circRNA的表達譜，發(fā)現肝纖維化模型組和正常對照組之間有69個circRNAs的差異表達，其中14個上調，55個下調。進一步研究[50]發(fā)現，circ-PWWP2A可通過充當miR-203和miR-223的分子海綿促進HSC的活化和增殖。Ji等[51]研究發(fā)現，Hsa_circ_0070963作為miR-223-3p的分子海綿，通過調節(jié)miR-223-3p和LEMD3來抑制HSC的激活，從而抑制肝纖維化。Wang等[52]研究表明circMTO1通過調節(jié)miR-17-5p和Smad7抑制肝纖維化，而Jin等[53]發(fā)現circMTO1亦可通過miR-181b-5p介導的PTEN表達抑制HSC活化。Li等[54]發(fā)現hsa_circ_0004018/hsa-miR-660-3p/TEP1軸有助于HSC的增殖和激活。Zhu等[55]研究表明，脂肪來源的間充質干細胞分泌的外泌體傳遞mmu_circ_0000623，通過激活自噬防止肝纖維化。外泌體circRNA研究處于起步階段，但其在尋找治療肝纖維化藥物及新靶點的道路上具有巨大的潛力。

4 小結與展望

部分研究已經證實外泌體中含有多種可調節(jié)肝纖維化的ncRNA，迄今為止，已經發(fā)現ncRNA可通過多種途徑調節(jié)肝纖維化，包括TGFβ/Smad、Wnt/β-catenin、S1PR2/SphK2和LET-7/HMGA2、AKT/mTOR/p27、PTEN/PI3K/Akt/mTOR/Snail、NF-κB、Notch、Hh、SIRT/P53、STAT3/Bcl-2-Beclin 1和MAPK等信號傳導途徑。并且ncRNA調節(jié)肝纖維化的中心環(huán)節(jié)是HSC。此外，ncRNA不同種類之間，也會產生相互作用，比如前面提到的circRNA充當miRNA的分子海綿，lncRNA作為miRNA的ceRNA以及siRNA對于其他ncRNA的干擾作用等。目前對于ncRNA之間的關聯(lián)性研究相對較少，因此，進一步研究不同類型的ncRNA之間的串擾和表觀遺傳網絡的復雜級聯(lián)，可能會突出關于肝纖維化進展的新發(fā)現，最終為肝纖維化的治療提供一些新的策略。然而外泌體和ncRNA及其之間的調控機制還需要進一步研究。從而為尋找肝纖維化治療藥物及尋找潛在靶點提供幫助。肝纖維化是一個可逆轉的病理過程，因此肝纖維化的早期干預在肝纖維化的治療過程中顯得尤為重要。但由于肝纖維化的發(fā)病機制復雜，調控的通路涉及眾多，目前西藥沒有特效藥物，且調控單一靶點的藥物很難在臨床上發(fā)揮良好的療效，因此具有復合成分，多靶點特點的中藥顯示了獨特的優(yōu)勢。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：錢南南負責課題設計，資料分析，撰寫論文；唐露露、魏濤華負責課題設計，修改論文；楊悅、郝文杰參與收集數據；楊文明負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。