易烽明， 辛龍祥， 馮 龍

1 南昌大學第二附屬醫(yī)院 腫瘤科， 南昌 330006； 2 江西省腫瘤醫(yī)院 內科， 南昌 330029

肝內膽管細胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA)為第二常見的肝惡性腫瘤，大多患者在診斷時已處于腫瘤晚期，無法行根治性切除[1]。然而，對于無法根治性切除的膽管癌患者，目前的標準治療效果有限，中位總生存率時間(overall survival，OS)<1年[2]?；诩韧墨I，許多危險因素與膽管癌相關，但關于膽管癌的發(fā)病機制的證據尚有限[3]。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類具有組織和發(fā)育特異性RNA，由外顯子和/或內含子序列通過反向剪接產生。circRNA的生物學功能包括調節(jié)轉錄、與線性RNA競爭、miRNA海綿、翻譯蛋白質、調節(jié)肽的翻譯等功能[4]。越來越多的證據證明circRNA在惡性腫瘤中異常表達，失調的circRNA影響許多細胞功能，包括細胞增殖信號、細胞遷移和侵襲、細胞凋亡和血管生成等，其大多數是通過作為miRNA海綿靶向miRNA而發(fā)揮作用。目前已有部分研究探索circRNA在iCCA中的功能，如cirRNA CDR1as在腫瘤組織中高表達，與TNM分期、淋巴結浸潤、術后復發(fā)有關[5]；circ-SMARCA5與ECOG評分、TNM分期和CA19-9狀態(tài)呈負相關[6]；部分circRNA還可能與iCCA細胞系的遷移、侵襲和增殖有關。體外研究[7]發(fā)現iCCA細胞系中circRNA CDR1as水平顯著升高，其通過靶向miR-614促進了iCCA細胞的增殖、遷移和侵襲；與周圍正常組織相比，iCCA組織中circ_0000284表達增加，通過靶向LY6E促進iCCA細胞系的遷移、侵襲和增殖，其也是iCCA的一個潛在生物標志物[8]。另有研究[9]確定了CIRC2174可能是iCCA的潛在遺傳途徑，其可通過作為miR-149海綿靶向OCT-2；circ-0000284可促進iCCA的進展，并可通過外顯子直接從iCCA細胞轉移到周圍的正常細胞[10]；circ_0001649過表達通過誘導iCCA細胞凋亡，從而抑制iCCA細胞增殖、遷移和侵襲[11]；circ_0005230作為miR-1238和miR-1299海綿，可能是治療iCCA的有效靶點[12]。

本研究旨在通過組織芯片分析，鑒定circRNA在iCCA中的異常表達，并探討顯著差異表達的circRNA在iCCA中的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 配對樣本circRNA芯片檢測及circRNA_000585定量PCR驗證 選取2019年7月—12月南昌大學第二附屬醫(yī)院收治的3例iCCA患者，iCCA的診斷基于術后病理。微陣列雜交芯片遵循參考文獻[13]的方法，分析了3組配對的iCCA組織標本和癌旁組織。兩組間差異表達的circRNA通過火山圖分析鑒定。差異表達的circRNA通過倍數差異(FoldChange，FC)過濾鑒定。通過t檢驗分析是否具有統(tǒng)計學意義。FC>1.5和P<0.05的circRNA為具有顯著差異表達。收集同一時期15例iCCA樣本，選擇并鑒定FC>3和P<0.05的circRNA，通過實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)對15組配對患者進行驗證，發(fā)現15組配對患者中iCCA的circRNA_000585顯著上調。circRNA_000585和內參的PCR信息見表1。

表1 circRNA_000585和內參PCR信息

1.2 miR-615-5p定量PCR驗證 利用TargetScan和miRanda預測軟件對circRNA/miRNA相互作用進行了預測，發(fā)現miR-615-5p與circRNA_000585相互作用，并通過RT-PCR鑒定miR-615-5p的表達。miR-615-5p和內參的PCR信息見表2。

表2 miR-615-5p和內參PCR信息

1.3 AMOT/YAP定量PCR驗證 microRNA/蛋白相互作用是基于miRPathDB軟件。發(fā)現miR-615-5p靶向AMOT，并通過RT-PCR鑒定AMOT的表達。結合蛋白質相互作用網絡和功能分析，發(fā)現AMOT與YAP相互作用，并通過RT-PCR鑒定YAP的表達。AMOT/YAP和內部參考的PCR信息見表3。

表3 AMOT/YAP和內參PCR信息

2 結果

2.1 iCCA組織和癌旁組織circRNA芯片檢測結果 iCCA組織和癌旁組織circRNAs的差異表達見圖1、2。117個circRNAs在iCCA中上調，104個circRNAs在iCCA中下調，其中有10個circRNAs在iCCA組織中3倍上調于癌旁組織 (circRNA_002172、circRNA_002144、circRNA_001588、circRNA_000166、circRNA_000585、circRNA_000167、circRNA_402608、circRNA_006853、circRNA_001589、circRNA_008882)，3個circRNAs在iCCA組織中表達低于癌旁組織的1/3 (circRNA_406083、circRNA_104940、circRNA_006349) (圖3、4)。進一步擴大樣本驗證發(fā)現15例iCCA患者的circRNA_000585與配對癌旁標本相比顯著上調(t=3.607，P=0.003)(圖5)。

2.2 miR-615-5p驗證結果 通過RT-PCR比較15例配對患者中miR-615-5p的表達,與癌旁相比，iCCA顯著下調(t=5.724，P<0.001)(圖6)。

2.3 AMOT/YAP驗證結果 通過RT-PCR鑒定AMOT/YAP的表達，發(fā)現AMOT在iCCA中的表達顯著上調(t=2.664，P=0.019)(圖7)。此外，在iCCA中，YAP顯著上調(t=2.986，P=0.009 8)(圖8)。

圖1 iCCA與癌旁組織circRNAs表達的熱圖

注：a，散點圖；b，火山圖。圖2 circRNAs表達的散點圖和火山圖

圖3 與癌旁組織相比iCCA中上調的circRNAs

圖4 與癌旁相比iCCA中下調的circRNAs

圖5 iCCA與癌旁中circRNA_000585的表達情況

3 討論

circRNA在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用，其中包括作為miRNA海綿、親本基因表達、轉錄調控和轉錄后蛋白翻譯等功能。在體液(如血漿、唾液)中高度穩(wěn)定，這個特點使circRNA成為腫瘤的理想生物標志物[14]。circRNA還可通過腫瘤微環(huán)境影響癌癥的惡性行為從而發(fā)揮作用[15]。

圖6 iCCA與癌旁組織中mir-615-5p的表達情況

圖7 iCCA與癌旁組織中AMOT的表達情況

圖8 iCCA與癌旁組織中YAP的表達情況

本研究試圖探討膽管癌中所有相關的circRNA，以期望發(fā)現iCCA中circRNA的差異表達。采用高通量circ-RNA微陣列芯片、生物信息學分析等方法檢測了差異表達的circRNA。最終發(fā)現117個circRNAs在iCCA中上調，104個circRNAs在iCCA中下調，其中有10個circ-RNAs在iCCA組織中3倍上調于癌旁組織，3個circRNAs在iCCA組織中表達低于癌旁組織的1/3。進一步擴大樣本驗證發(fā)現15例iCCA患者的circRNA_000585與相應癌旁標本相比顯著上調。circRNA_00585是iCCA中一種新的circRNA，本研究試圖探討circRNA_000585在iCCA中的潛在作用。

circRNA可通過circRNA-DNA、circRNA-RNA、circ-RNA-蛋白質相互作用而建立調控網絡。miRNA海綿是circRNA最常見的靶分子，circRNA-miRNA-RNA調控軸與細胞信號的多種功能有關，與腫瘤發(fā)生或生物學行為相關[16]。隨后作者基于TargetScan和miRanda預測了circRNA/miRNA相互作用，并將所有差異表達的circRNA與circRNA/miRNA相互作用信息進行了詳細的注釋。發(fā)現miR-615-5p與circRNA_000585相互作用，并通過RT-PCR鑒定miR-615-5p的表達。與癌旁相比，miR-615-5p在iCCA中顯著下調。miR-615是一種高度保守的miRNA，參與胚胎發(fā)生及生長發(fā)育的調控，還參與細胞生長、增殖和遷移的調控，充當抑癌因子或腫瘤啟動子。既往研究[17]表明，miR-615-5p是一種腫瘤抑制因子，可預防腫瘤侵襲和轉移。

本研究通過miRPathDB軟件找到miR-615-5p目標基因AMOT，同時STRING蛋白相互作用網絡和功能分析發(fā)現AMOT和YAP的相互作用。通過RT-PCR鑒定AMOT/YAP的表達，發(fā)現AMOT在iCCA中與癌旁相比有上調。此外，YAP在iCCA中顯著上調。 AMOT為一種細胞外蛋白，可控制細胞遷移、緊密連接形成、細胞極性和血管生成。研究[18-19]表明AMOT參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展以及Hippo-YAP1通路。AMOT可促進YAP的核易位，并作為YAP-TEAD復合物的轉錄輔助因子，以促進膽管上皮細胞的增殖和肝臟的癌癥發(fā)展。AMOT家族成員在大多數惡性腫瘤中促進癌細胞的增殖和侵襲。然而，在膠質母細胞瘤、卵巢癌和肺癌中，AMOT可抑制癌細胞的生長。此外，AMOT對YAP的調控，其為促進YAP內化到細胞核或保留YAP在細胞質中也存在爭議[20]。YAP被發(fā)現在許多惡性腫瘤中表達上調，可促進細胞增殖和過度生長[21]。在體外，YAP在細胞中的過表達可促進細胞增殖，進而導致癌癥的發(fā)生[22]。YAP還具有其他功能，如誘導上皮間充質轉換[23]。最近的研究[24]表明，YAP/TAZ介導的代謝改變有助于腫瘤轉移。YAP可以通過轉錄增強締合域轉錄因子促進iCCA的腫瘤增殖、血管生成和耐藥[25]。YAP/TAZ的過度激活可促進iCCA的發(fā)展，WWC1和NF2等分子可通過抑制YAP/TAZ的致癌活性來抑制iCCA的發(fā)展[26]。

由于本研究納入的患者規(guī)模較小，后續(xù)筆者將收集更多的樣本以證實結果。在本研究中涉及的潛在途徑，仍需在體外和體內驗證，進而揭示相關通路的詳細機制。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：易烽明、辛龍祥負責資料分析和數據收集；易烽明、馮龍負責統(tǒng)計分析，文章撰寫，文章修改及定稿。