齊婧姝， 平大冰， 孫 鑫， 薛靜波， 陶艷艷， 彭 淵， 劉成海,,3,4

1 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 肝病研究所， 上海 201203； 2 上海市中醫(yī)臨床重點實驗室， 上海 201203；3 肝腎疾病病證教育部重點實驗室， 上海 201203； 4 上海中醫(yī)健康服務協(xié)同創(chuàng)新中心， 上海 201203

原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)包括肝細胞癌和肝內(nèi)膽管細胞癌[1]，其病死率居全世界惡性腫瘤第三位[2]，我國每年肝癌死亡人數(shù)占全球肝癌死亡的51%[3]。肝癌往往起病隱匿、進展迅速、復發(fā)快、預后差[4]，是危害人類健康的重大疾病。因此，對肝癌的防治是臨床研究的重點。

扶正化瘀方(fuzheng huayu，F(xiàn)ZHY)由丹參、冬蟲夏草、桃仁、松花粉、絞股藍、五味子6味藥組成，適用于乙型肝炎肝纖維化屬瘀血阻絡，肝腎不足證者。本課題組前期工作[5]表明，該方可有效改善肝炎后肝硬化患者肝功能、改善肝組織炎癥，并逆轉(zhuǎn)肝纖維化；方中多味藥及其不同化學成分在肝纖維化各個病理環(huán)節(jié)融對抗、保護、調(diào)節(jié)于一體，標本兼治。已有臨床和基礎研究表明，F(xiàn)ZHY可以降低肝癌的惡性程度[6]，防治實驗性肝癌的發(fā)生率[7-9]，然而其防治肝癌的活性成分以及潛在的作用機制尚不清楚。因此，基于中藥復方多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮藥理機制的作用特點，本研究以FZHY為載體，運用網(wǎng)絡藥理學方法，從分子網(wǎng)絡水平系統(tǒng)探索該方多成分、多靶點與肝癌疾病間復雜網(wǎng)狀關系，為后續(xù)實驗研究提供線索。通過整合多個數(shù)據(jù)庫信息收集整理FZHY的主要化學成分及其靶標信息、肝癌相關基因信息，構(gòu)建FZHY治療肝癌的成分-靶標網(wǎng)絡，旨在通過網(wǎng)絡分析解析FZHY治療肝癌的作用機制，為臨床和基礎科研提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 搜索FZHY主要活性成分的作用靶點 FZHY中各味藥的成分信息從TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php，數(shù)據(jù)更新至2020-12-20)、BATMAN(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/，數(shù)據(jù)更新至2020-12-20)、Drugbank(https://go.drugbank.com/，數(shù)據(jù)更新至2020-12-20)等數(shù)據(jù)庫中檢索獲得；各成分的靶標信息從TCMSP、Drugbank中獲取，構(gòu)建FZHY有效成分潛在的靶標群。方中各味藥的歸經(jīng)信息從《中國藥典》(2015年版)中獲取。TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選過濾標準為：口服生物利用度(oral bioavailable,OB)≥30%且類藥性(drug likeness,DL)≥0.18，獲得FZHY多成分靶標基因。

1.2 提取肝癌相關基因 通過檢索“Liver cancer”“Hepatic carcinoma”“Hepatoma”“Hepatocellular carcinoma”等關鍵詞，從GeneCards人類基因數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org，數(shù)據(jù)更新至2020-12-20)、OMIM在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM, https://omim.org，數(shù)據(jù)更新至2020-12-20)中搜索肝癌相關的基因，構(gòu)建肝癌致病基因的靶點數(shù)據(jù)集，獲得肝癌疾病靶標基因。

1.3 FZHY抗肝癌靶標網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析 對FZHY多成分靶標基因和肝癌疾病靶標基因進行基因去重，繪制韋恩圖，獲得FZHY靶標群與肝癌的共有基因，并在STRING數(shù)據(jù)庫(http://sring-db.org/)構(gòu)建蛋白-蛋白互作關系(protein-protein interaction，PPI)分析。PPI分析模式限定為“Multiple proteins”，物種設定為“Homo Sapiens”，設置可信度≥0.7，隱藏孤立的蛋白，對數(shù)據(jù)進行分析后導出PPI網(wǎng)絡圖，再利用Cytoscape軟件建立多成分-基因-疾病網(wǎng)絡模型。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 利用R語言中的“colorspace”“stringi”“ggplot2”“clusterProfiler”“enrichplot”“org.Hs.EG.db”包對FZHY有效成分潛在作用靶點進行功能注釋(gene ontology,GO)，即主要進行分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細胞組成(cellular component，CC)3個部分的富集分析，并對相關基因進行KEGG通路富集分析，設定顯著性為P<0.05。

1.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡 結(jié)合FZHY抗肝癌的主要成分、核心靶點與KEGG分析所得通路，運用Cytoscape軟件繪制成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖，分析其整體關聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 FZHY包含的成分及對應靶標 FZHY由6味中藥組成，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18篩選出中藥包含的主要成分共142個。合并各成分的靶標基因，除去被多個成分共同調(diào)控的重復基因，獲得197個藥物靶標基因(表1)。

2.2 FZHY的靶標網(wǎng)絡分析 分別以檢索詞“Liver cancer”“Hepatic carcinoma”“Hepatoma”“Hepatocellular carcinoma”在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索肝癌靶標基因，分別獲得相應疾病相關基因數(shù)(表2)。合并去除重復基因，共獲得疾病相關基因17 869個。

表2 在線數(shù)據(jù)庫檢索關鍵詞及疾病相關基因數(shù)

2.3 FZHY成分-基因-肝癌疾病靶標基因網(wǎng)絡分析 對FZHY多成分靶標基因和肝癌疾病靶標基因進行基因去重，繪制韋恩圖，獲得FZHY靶標群與肝癌靶標群的共有基因192個(藥物-疾病靶標基因)(圖1)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建FZHY有效成分-肝癌靶標基因網(wǎng)絡圖(附錄1)，得到FZHY治療肝癌的潛在化合物有95種，其中與肝癌靶標基因連線最多為槲皮素和木犀草素(Mol ID: MOL000098、MOL000006)，提示槲皮素和木犀草素是FZHY調(diào)控肝癌的重要活性成分。PPI網(wǎng)絡分析藥物-疾病靶標基因間的關系(附錄2)，根據(jù)基因-基因連線數(shù)分析PPI網(wǎng)絡核心基因，顯示主要為INS、IL-6、EGFR等基因(圖2)，提示這些靶標能被FZHY多味中藥和多個成分共同調(diào)控，因此在靶標網(wǎng)絡中可能具有更重要的影響。

表1 FZHY包含化學成分的對應靶標數(shù)

圖1 基于GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫預測的肝癌與FZHY的靶點基因交集

圖2 FZHY治療肝癌的關鍵靶標基因

2.4 網(wǎng)絡模型中重要靶標生物功能分析 針對核心靶點進行GO-BP分析，確定靶蛋白具有顯著性意義(P<0.05)的生物學過程主要涉及：對藥物的反應、對氧水平的反應、對類固醇激素的反應、對缺氧的反應、對金屬離子的反應、對氧水平降低的反應、對氧化應激的反應、細胞對化學應激的反應、對酮的反應、對營養(yǎng)物質(zhì)的反應。GO-CC分析結(jié)果提示涉及的細胞組分主要有：突觸后膜、膜筏、膜微域、膜區(qū)、突觸膜、囊腔、分泌顆粒腔、細胞質(zhì)囊腔、突觸膜整體成分、突觸后膜整體成分等。GO-MF分析結(jié)果提示涉及的分子功能主要有：DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、羧酸結(jié)合、有機酸結(jié)合、類固醇結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、核受體活性、配體-激活轉(zhuǎn)錄因子活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、半胱氨酸-類型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程、半胱氨酸-類型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號通路等(附錄3)。

對FZHY靶標網(wǎng)絡中的關鍵基因進行KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)前50位信號通路有22條與肝癌密切相關，具體見表3和附錄4。

用Cytoscape軟件構(gòu)建FZHY治療肝癌關鍵靶標與關鍵信號通路的網(wǎng)絡圖(附錄5)，發(fā)現(xiàn)肝癌22條關鍵信號通路與FZHY治療肝癌的80個潛在靶點關系密切。

表3 FZHY治療肝癌關鍵靶標的KEGG富集通路

3 討論

在我國，肝癌是肝炎后肝硬化最常見的并發(fā)癥[10]，給患者和社會帶來沉重的負擔。盡管外科手術切除及肝移植、射頻消融、介入治療以及個性化化療方案和靶向藥物的應用使得肝癌患者獲益良多，但復發(fā)仍是臨床所面臨的重大難題。對于難以手術切除肝癌的綜合治療方案，中西結(jié)合治療是提高肝癌療效的一個重要途徑[11-12]。FZHY(制劑為膠囊或片劑)由丹參、桃仁、蟲草菌絲、松花粉、五味子、絞股藍組成，對肝炎后肝硬化具有良好的治療效果[13]，已有國內(nèi)同行發(fā)表FZHY抗肝癌的相關臨床與基礎研究，但對于其抗肝癌的活性成分、作用靶點以及分子機制尚不完全明確。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法從分子網(wǎng)絡角度系統(tǒng)分析了FZHY對肝癌的潛在治療機制，通過TCMSP平臺，篩選得到FZHY活性成分142種，藥物靶點基因197個；將FZHY對應的靶點與肝癌的疾病靶點基因取交集，獲得交集基因192個，篩選得到潛在化合物95種，其中部分化合物抗肝癌的有效性及其藥理機制已被證實，起到重要調(diào)控作用的活性成分有：槲皮素、木犀草素等。據(jù)報道，槲皮素抗肝癌的作用可能與其滅活caspase/Cyto-c通路、抑制AP-2β/hTERT、NF-κB/COX-2、阻斷Akt/ERK1/2信號通路及競爭性抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT-1)密切相關[14-15];木犀草素可通過TGFβ1、p53和Fas/FasL三條信號通路抑制肝癌細胞生長[16]。上述化合物位于FZHY治療肝癌疾病-活性成分-靶基因網(wǎng)絡的核心，可能在FZHY抗肝癌過程中起到重要作用。

進一步對活性成分靶點-信號通路網(wǎng)絡進行分析，得到80個抗肝癌靶點，涉及22條信號通路。FZHY潛在作用的關鍵靶點有INS、IL-6、EGFR等；主要通過調(diào)控細胞凋亡、TNF等信號通路而抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展，并促進肝癌細胞凋亡等多途徑、多靶點發(fā)揮作用。研究顯示，胰島素可促進肝癌細胞增殖和侵襲，抑制細胞的凋亡，其功能與 Cleaved caspase 3、MMP-2、MMP-9 蛋白表達及 PI3K/AKT 信號通路密切相關[17]；IL-6在人肝細胞癌中的表達顯著上調(diào)，與肝癌惡性進展呈正相關[18]，其對肝癌的正向調(diào)節(jié)作用可能與其抑制miRNA-197的表達來調(diào)節(jié)STAT3總蛋白質(zhì)的表達，繼而促進p-STAT3的表達關系密切[19]；文獻報道，在29%～85%的肝癌組織中有EGFR過表達的現(xiàn)象[20]，甚至有專家建議將EGFR作為肝癌治療的靶點[21]，其機制可能為EGF/EGFR通過PI3K/AKT信號通路磷酸化p300 Ser1834位點，促進組蛋白H3K9位點乙?；笵KK1的轉(zhuǎn)錄增加，進而導致肝癌細胞的轉(zhuǎn)移[22]。

通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZHY對于肝癌的調(diào)控主要集中在DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體結(jié)合等過程，提示FZHY可能通過抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡而發(fā)揮作用。通過KEGG通路富集分析追蹤FZHY治療肝癌的代謝通路，并作FZHY治療肝癌關鍵靶標的關鍵信號通路-基因網(wǎng)絡圖分析整體聯(lián)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZHY主要作用于細胞凋亡、TNF等信號通路。其中凋亡信號通路可以影響胰島素的產(chǎn)生和釋放[23-24]，從而抑制腫瘤細胞增殖和侵襲能力，促進其凋亡。由此可知，F(xiàn)ZHY可能可以通過上述途徑發(fā)揮對肝癌的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡藥理學技術手段探討了FZHY活性成分與肝癌疾病及其相關基因的網(wǎng)狀關聯(lián)，通過研究該方多成分、多靶點、多途徑作用機制，為進一步深入開展的實驗研究提供了參考和線索。本課題組研究將圍繞其抗肝癌藥效物質(zhì)及作用機制開展進一步基礎與臨床轉(zhuǎn)化研究，以期開發(fā)出更適用于臨床治療肝癌的中藥制劑。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：齊婧姝負責撰寫修改論文；平大冰、孫鑫、薛靜波參與文獻的收集整理；彭淵、陶艷艷負責擬定寫作思路及制作網(wǎng)絡圖；劉成海負責指導撰寫文章并最后定稿。

附錄1～5見二維碼