向曉波 嚴(yán)履冰 周艷萌

(1. 遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔外科，貴州遵義563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)2017級(jí)，貴州遵義563000；3.遵義醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563000)

高效廣譜抗生素的廣泛使用、免疫抑制劑濫用、艾滋病及血液系統(tǒng)惡性腫瘤等因素，造成真菌感染率和致死率不斷增長(zhǎng)，其中白色念珠菌(Candidaalbicans)就是真菌性感染的常見(jiàn)病原體之一[1]，同時(shí)也是最常見(jiàn)的醫(yī)院獲得性真菌感染的病原體，常在植入的醫(yī)療器械上形成生物膜，導(dǎo)致致命的播散性疾病[2]。目前唑類和多烯類抗生素是治療白色念珠菌感染的主要藥物，這些藥物均存在一定的毒性，且長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致白色念珠菌耐藥性不斷增強(qiáng)[3]。白色念珠菌的一個(gè)關(guān)鍵毒力因子是其在酵母和菌絲體兩種形態(tài)之間可以進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)化，此能力在組織入侵、抵抗吞噬和生物膜形成中起著重要作用。生物膜具有引發(fā)或延長(zhǎng)感染的潛力，并對(duì)傳統(tǒng)抗真菌治療產(chǎn)生高水平的耐藥性[4-5]。近來(lái)研究[6-8]顯示，中藥及中藥提取物在抗生物膜方面具有較好的作用。中藥厚樸(Mangnolia officinalis)為木蘭科木蘭屬植物厚樸或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮?，F(xiàn)代藥理試驗(yàn)[9]證明，厚樸具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗炎、保護(hù)心腦血管、抗?jié)円约翱鼓茸饔谩Ｌ镉裰榈萚10]發(fā)現(xiàn)和厚樸酚對(duì)白色念珠菌黏附及其生物膜的形成及厚度均有抑制作用。筆者前期的研究[11-12]顯示，厚樸冷浸液對(duì)白色念珠菌早期黏附和中期生物膜形成有抑制作用，厚樸酚通過(guò)抑制白色念珠菌的早期黏附而有效降低其致病性，并對(duì)已形成的生物膜具有明顯的抑制作用。本課題組擬在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討厚樸煎劑抗白色念珠菌的作用機(jī)制，為厚樸用于臨床抗真菌感染提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

白色念珠菌 (Candidaalbicans10231,C.albicans,10231) 標(biāo)準(zhǔn)株由遵義醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.2 藥物與試劑

芽管液體培養(yǎng)基按照參考文獻(xiàn)[13]制備；厚樸購(gòu)于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局；酵母蛋白胨葡萄糖 (yeast peptone glucose，YPG) 液體培養(yǎng)基依據(jù)文獻(xiàn)[14]配制；沙氏瓊脂培養(yǎng)基(sabouraud agar medium，SDA)購(gòu)于杭州濱和微生物試劑有限公司；LIVE/DEAD細(xì)菌活力檢測(cè)試劑盒(L13152)購(gòu)于賽默飛世爾公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的刀豆蛋白 A(FITC-conA)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;SYBR Premix Ex.TaqTM熒光定量 PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司；CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1C.albicans菌懸液的制備

白色念珠菌劃線接種于SDA上，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落再劃線接種于SDA培養(yǎng)基分離純化3次，然后挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種于YPG液體培養(yǎng)基中，37 ℃、90 r/min 搖床培養(yǎng)過(guò)夜活化2次，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整菌液濃度至2× 106個(gè)/mL，備用。

1.2.2 藥物的配制

60 g厚樸粉末加入1 600 mL三蒸水中,煎煮3次，收集3次的液體混合并濃縮至400 mL獲得厚樸煎劑(0.15 g/mL)保存液，無(wú)菌濾器過(guò)濾并分裝放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時(shí)，將厚樸煎劑稀釋成 250、125、62.5、31.25、15.625 mg/L。

1.2.3 芽管形成試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組以2×106個(gè)/mL的菌液1 mL與上述各濃度藥液1 mL混合，空白對(duì)照組以1 mL菌液與1 mL芽管液體培養(yǎng)基混合，每組3支復(fù)管，37 ℃培養(yǎng)30 h離心去上清，用100 μL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡(jiǎn)稱生理鹽水)重懸，每管取10 μL 涂片革蘭染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)菌中正常芽管數(shù)和受抑制芽管數(shù)(正常芽管長(zhǎng)度一般超過(guò)菌體直徑 2 倍及以上，受抑制芽管長(zhǎng)度小于或等于菌體直徑)，計(jì)算均值和芽管生成率(芽管生成率=帶芽管的白色念珠菌數(shù)目/100)[13]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌早期黏附基因1(agglutinin-likesequencefamily，ALS1)、ALS2、ALS3的影響

1.2.4.1 樣品的制備

白色念珠菌轉(zhuǎn)種于YPG液體培養(yǎng)基中37 ℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體，用芽管液體培養(yǎng)基調(diào)整菌濃度為2×106個(gè)/mL，以每瓶80 mL分裝于克氏瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置90 min，吸棄上清，無(wú)菌PBS洗3次，實(shí)驗(yàn)組分別加入31.25、15.625、7.812 5 mg/L厚樸煎劑，空白對(duì)照組加入等量的芽管液體培養(yǎng)基，37 ℃ 靜置培養(yǎng)1 h，吸棄培養(yǎng)基，用生物膜刮刀刮下黏附在瓶壁上的菌體，收集后離心去上清，用DEPC水洗1次，離心棄上清備用。

1.2.4.2 提取RNA

取沉淀用Novelase消化液懸重，室溫消化10 min后，每管沉淀中加入1 mL Trizol，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA 的濃度。

1.2.4.3 引物及其合成

根據(jù)文獻(xiàn)[15]中ALS1、ALS2、ALS3的基因序列，采用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)白色念珠菌ALS1 mRNA、ALS2 mRNA、ALS3 mRNA 和 18 S-RNA 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)引物(表1)，各引物由上海生工生物工程公司合成。

表1 特異引物序列和PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.2.4.4 qRT-PCR定量分析

以1 μg總 RNA 為模板，反應(yīng)參數(shù)：95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃ 10 s，39個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因6個(gè)復(fù)管，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)以18S RNA 為內(nèi)參，qRT-PCR 數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法評(píng)估管家基因和ALS1、ALS2、ALS3的表達(dá)水平。

1.2.5 熒光顯微鏡觀察厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌成熟期生物膜的影響

無(wú)菌1 cm×1 cm的蓋玻片用胎牛血清浸泡12 h備用。蓋玻片放入24孔板，每孔加入上述菌液1 mL，37 ℃靜置培養(yǎng)72 h，形成白色念珠菌成熟期生物膜，用 PBS 洗3次去除浮游菌，實(shí)驗(yàn)組每孔加入0.5 mL上述濃度厚樸煎劑和0.5 mL芽管液體培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加入1 mL芽管液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，用無(wú)菌PBS 洗3次去除浮游菌，每孔加入20 μL FITC-conA室溫避光染色1 h，冷PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌成熟期生物膜的影響

生物膜制備同上，15.625 mg/L厚樸煎劑處理48 h，PBS 洗3次去除浮游菌后，3%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定4 h，PBS 洗4次，每次15 min；去除PBS，加入1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))四氧化鋨于旋轉(zhuǎn)器上固定1.5 h，再用蒸餾水漂洗4次，每次10 min；以梯度乙醇脫水后，樣本先放于臨界點(diǎn)干燥儀中干燥，再將樣本放于真空鍍膜機(jī)中噴金，然后于掃描電鏡下觀察。

1.2.7 激光共聚焦顯微鏡觀察厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌成熟期生物膜內(nèi)菌活力的影響

按照上述方法制備72 h生物膜，15.625 mg/L厚樸煎劑處理48 h，PBS洗3次去除浮游菌后，每孔加10 μL SYT09/PI室溫避光染色30 min，用激光共聚焦顯微鏡488 nm氬激光進(jìn)行激發(fā)，PI發(fā)射波長(zhǎng)635 nm，鏡下為紅光；SYT09發(fā)射波長(zhǎng)500 nm，鏡下為綠光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌芽管形成的影響

白色念珠菌革蘭染色呈陽(yáng)性，顯微鏡下空白對(duì)照組(0 mg/L)白色念珠菌以交織成網(wǎng)的真菌絲為主，同時(shí)伴有少量的圓形或卵圓形的芽生孢子及假菌絲；各濃度厚樸煎劑均可抑制白色念珠菌的芽生孢子、假菌絲及真菌絲的形成，且抑制作用具有濃度依賴性(圖1A)。芽管計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，隨厚樸煎劑濃度的升高受抑制芽管數(shù)量增加，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。

圖1 不同濃度厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌芽管形成的影響Fig.1 Effect of Magnolia officinalis decoction with different concentrations on germ tube formation of Candida albicansA: effects of different concentrations of Magnolia officinalis decoction on germ tube formation of Candida albicans(Gram staining)，scale bar=5 μm; B: inhibitory rate of Magnolia officinalis decoction at different concentrations on germ tube of Candida albicans; *P<0.05 vs control group(0 mg·L-1).

2.2 厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌早期黏附基因相對(duì)表達(dá)量的影響

黏附早期，空白對(duì)照組ALS3基因的表達(dá)最高，ALS2基因其次，ALS1基因表達(dá)最低，實(shí)驗(yàn)所用3個(gè)濃度厚樸煎劑均能使ALS1、ALS2、ALS3 mRNA的表達(dá)下調(diào)，且具有濃度依賴性，與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表2，圖2。

表2 厚樸煎劑對(duì)白念珠菌黏附基因相對(duì)表達(dá)量的影響

圖2 厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌早期黏附基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of Magnolia officinalis decoction on relative expression of early adhesion gene of Candida albicans *P<0.05 vs control group;ALS： agglutinin-like sequence family.

2.3 不同濃度厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌成熟生物膜的影響

FITC-conA與生物膜中的胞外多糖結(jié)合，熒光顯微鏡下呈綠色熒光?？瞻讓?duì)照組隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)生物膜不斷增厚，而厚樸煎劑作用24、48和72 h后白色念珠菌生物膜結(jié)構(gòu)被破壞，72 h鏡下主要見(jiàn)散在的孢子相白色念珠菌，未見(jiàn)片狀生物膜(圖3～圖5)。SEM觀察15.625 mg/L厚樸煎劑作用48 h后對(duì)生物膜的影響，空白對(duì)照組白色念珠菌生物膜由分泌物包裹芽體、交織成網(wǎng)的菌絲形成，藥物組生物膜的結(jié)構(gòu)被破壞，鏡下白色念珠菌以孢子相為主，孢子失去典型形態(tài)，大小不均，表面有分泌物包裹，同時(shí)可見(jiàn)少量被抑制的菌絲(圖6)。

圖3 不同濃度厚樸煎劑作用24 h對(duì)白色念珠菌生物膜的影響Fig.3 Effect of Magnolia officinalis decoction on Candida albicans biofilm for 24 hours (scale bar=20 μm)

圖4 不同濃度厚樸煎劑作用48 h對(duì)白色念珠菌生物膜的影響Fig.4 Effect of Magnolia officinalis decoction on Candida albicans biofilm for 48 hours (scale bar=20 μm)

圖5 不同濃度厚樸煎劑作用72 h對(duì)白色念珠菌生物膜的影響Fig.5 Effect of Magnolia officinalis decoction on Candida albicans biofilm for 72 hours (scale bar=20 μm)

圖6 掃描電鏡觀察厚樸煎劑作用48 h對(duì)白色念珠菌生物膜的影響Fig.6 Effect of Magnolia officinalis decoction for 48 hours on Candida albicans biofilm was observed by SEMSEM: scanning electron microscope.

2.4 厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌成熟期生物膜內(nèi)菌活力的影響

共聚焦顯微鏡下，死菌被PI 染色發(fā)紅色熒光, 活菌被SYT09染色發(fā)綠色熒光，橙色為死活菌重疊所致?？瞻讓?duì)照組白色念珠菌主要為交織成網(wǎng)的菌絲，以活菌為主，僅見(jiàn)少量死菌；15.625 mg/L厚樸煎劑作用48 h后，白色念珠菌以孢子相為主，死菌數(shù)量明顯增加，可見(jiàn)少量被抑制的菌絲(圖7)。

圖7 厚樸煎劑作用48 h對(duì)白色念珠菌生物膜內(nèi)菌活力的影響Fig.7 Effect of Magnolia officinalis decoction for 48 h on bacterial activity in Candida albicans biofilm (scale bar=20 μm)A-C： Candida albicans is mainly mycelium； D-F： Candida albicans is mainly spore phase

3 討論

中藥湯劑是我國(guó)應(yīng)用最多、最早的一種劑型，其制法簡(jiǎn)單，用水為溶劑，起效較快，目前在中醫(yī)臨床仍然廣泛使用，而中藥濃煎劑則是在中藥湯劑的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，它是將單方或復(fù)方的中草藥經(jīng)水煎煮，濃縮成一定容量的液體制劑[16]。本研究制備中藥厚樸煎劑，探討其對(duì)白色念珠菌的芽體、菌絲及生物膜的作用。念珠菌病是最常見(jiàn)的侵襲性真菌感染，目前在全球醫(yī)院中侵襲性真菌感染排第三至第四位，而白色念珠菌仍然是念珠菌病的主要病因[17]。白色念珠菌是一種二相性真菌，從形態(tài)上分為酵母相和菌絲相，在一些因素的誘導(dǎo)下，酵母相可以向菌絲相轉(zhuǎn)換[18]，菌態(tài)轉(zhuǎn)換是白色念珠菌由定殖菌向致病菌轉(zhuǎn)變的一種標(biāo)志，與白色念珠菌致病性和生物膜形成密切相關(guān)[19-20]。本研究用芽管形成試驗(yàn)觀察厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌菌態(tài)轉(zhuǎn)換的影響，結(jié)果顯示通過(guò)抑制白色念珠菌芽管、假菌絲和真菌絲的形成以及酵母細(xì)胞的增殖，從而抑制白色念珠菌發(fā)生菌態(tài)轉(zhuǎn)換，芽管計(jì)數(shù)結(jié)果提示厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌芽管的抑制作用具有濃度依賴性。白色念珠菌生物膜的發(fā)育過(guò)程可分為四個(gè)主要階段:黏附、增殖、成熟和擴(kuò)散[17]，黏附階段是其形成生物膜與致病的基礎(chǔ)，因此抑制黏附是抗白色念珠菌生物膜感染的關(guān)鍵措施，而芽管的形成可以提高白色念珠菌的組織侵襲性和黏附力，厚樸煎劑抑制芽管形成說(shuō)明其可以抑制白色念珠菌的黏附[21]。白色念珠菌黏附性主要由其細(xì)胞表面蛋白黏附素完成，白色念珠菌ALS基因家族編碼的黏附素參與了該菌對(duì)宿主的黏附和生物膜的形成。以往的研究[22]表明ALS1、ALS2、ALS3在白色念珠菌體外生物膜形成過(guò)程中呈優(yōu)勢(shì)表達(dá)。因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了厚樸煎劑對(duì)ALS1、ALS2、ALS3基因的影響，qRT-PCR結(jié)果提示厚樸煎劑作用后可下調(diào)3個(gè)基因的表達(dá)，說(shuō)明厚樸煎劑可能是通過(guò)下調(diào)白色念珠菌早期黏附基因的表達(dá)從而影響其早期黏附；同時(shí)ALS1還是菌絲形成關(guān)鍵基因之一，厚樸煎劑作用后ALS1的下調(diào)導(dǎo)致白色念珠菌菌絲形成受到抑制。

真菌生物膜是指真菌黏附于惰性或活性實(shí)體的接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等物質(zhì)，將其自身包繞其中而形成的大量真菌聚集膜樣物，主要組成為菌絲[1]。本研究制備的白色念珠菌成熟期生物膜，在熒光顯微鏡下空白對(duì)照組生物膜由大量菌絲交織呈片狀，而厚樸煎劑作用后隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，未見(jiàn)大片狀生物膜，鏡下主要為孢子相白色念珠菌；掃描電鏡觀察生物膜發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組生物膜以分泌物包裹菌絲為主，15.625 mg/L 的厚樸煎劑作用48 h后，生物膜結(jié)構(gòu)被破壞，鏡下多見(jiàn)孢子相白色念珠菌，在菌體表面也包裹有分泌物，菌體大小不一。進(jìn)一步在共聚焦顯微鏡下觀察厚樸煎劑對(duì)成熟期生物膜中菌活力的影響，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組以菌絲和活菌為主，而15.625 mg/L的厚樸煎劑組以孢子相為主，且死菌數(shù)量明顯增加。共聚焦顯微鏡和芽管形成試驗(yàn)說(shuō)明厚樸煎劑可能是通過(guò)破壞成熟期生物膜的結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)入生物膜內(nèi)抑制芽管的形成從而發(fā)揮殺菌作用的。

綜上所述，厚樸煎劑早期可通過(guò)下調(diào)ALS1、ALS2、ALS3基因抑制白色念珠菌發(fā)生菌態(tài)轉(zhuǎn)換和生物膜的形成，同時(shí)可以破壞成熟期生物膜的結(jié)構(gòu)從而促進(jìn)藥物進(jìn)入生物膜內(nèi)抑制芽管形成并發(fā)揮殺菌作用。但是實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有進(jìn)一步檢測(cè)影響菌絲形成的基因、影響生物膜形成的信號(hào)通路等，因此厚樸煎劑對(duì)白色念珠菌菌絲形成及其生物膜的作用機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。