張 麗 王明洋 牛紅妹 張 蘭 李 林

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥學部 北京市神經(jīng)藥物工程技術研究中心 北京腦重大疾病研究院 神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

腦小血管病(cerebral small vascular disease, CSVD)是一類病理改變主要累及顱內小血管的疾病，臨床主要表現(xiàn)為腦卒中、認知功能障礙、精神異常等[1]。隨著社會人口老齡化的加劇，該病發(fā)病率日趨增高，且有研究[2]顯示CSVD可使腦卒中發(fā)病的風險增加2～10倍，誘發(fā)36%～67%癡呆患者發(fā)病，是引起腦卒中和血管性癡呆的主要原因[3-4]。腦白質損傷是CSVD引起病理變化的主要亞型，也是最常見典型的病理表現(xiàn)[5]。與CSVD相關的白質損害被認為是由慢性低灌注引起的，可導致認知障礙[6]。CSVD直接或間接誘發(fā)繼發(fā)性病變，威脅患者的健康和生活質量，給患者和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。因此，目前迫切需要開發(fā)治療CSVD的有效藥物。

淫羊藿黃酮(epimedium flavanoids, EF)是從淫羊藿中提取的主要成分，具有延緩衰老、調節(jié)免疫、抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸的作用[7-8]。前期研究[9]顯示EF可改善神經(jīng)細胞β-淀粉樣前體蛋白[myloid beta(A4)precursor protein, APP]轉基因小鼠的學習記憶障礙，改善雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone,CPZ)誘導的腦白質病變小鼠模型的神經(jīng)功能損傷，而EF是否能通過減輕白質損傷改善慢性低灌注引起的認知功能障礙，從而達到治療CSVD的目的尚未可知。本研究采用雙側頸總動脈結扎模型大鼠模擬CSVD的慢性腦缺血低灌注病理狀態(tài)，采用影像學及組織化學方法觀察EF對白質損傷的影響，為研制能夠改善認知功能障礙的新型抗CSVD藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

淫羊藿黃酮(epimediun flavanoids, EF)，由江蘇康緣藥業(yè)有限公司提供。尼莫地平片(nimodipine)，購自正大青春寶藥業(yè)，羧甲基纖維素鈉、蔗糖、多聚甲醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等購于北京法杰德化學試劑公司。

1.2 實驗動物

無特定病原體級(specific pathogen free, SPF) SD雄性大鼠，體質量280～300 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號：11400700139347。實驗動物倫理編號：AEEI-2018-132。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院SPF級動物房，適應性飼養(yǎng)1周后進行正式實驗。飼養(yǎng)溫度恒定為(22±3) ℃，相對濕度恒定為60%±5%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，自由進水及飼料。

1.3 動物分組及處理

采用數(shù)字表法將大鼠隨機分為5組，每組7只：假手術組(sham)，模型組(model)，100 mg/kg EF給藥組[model+EF(L)]，200 mg/kg EF給藥組[model+EF(H)]，陽性藥尼莫地平組(model+nimodipine，10 mg/kg)。雙側頸總動脈結扎術(permanent bilateral common carotid artery ligation, 2VO)術后24 h灌胃給藥，每天固定時間1次，連續(xù)給藥6周，sham、model組給予等體積的0.5%(質量分數(shù))羧甲基纖維素鈉。

1.4 模型制備

將SD大鼠深度麻醉后，行2VO,四肢固定在木板上,通過頸部腹側切口將雙側頸總動脈與頸部交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)分離，然后用5.0絲線結扎頸總動脈。假手術組除了沒有結扎頸頸總動脈外，其他操作與手術組相同。在整個實驗過程中，維持大鼠的體溫一直保持在37 ℃左右，縫合皮膚后，將大鼠放回籠子，待蘇醒后正常喂養(yǎng)。

1.5 新物體識別實驗

采用新物體識別實驗來評價2VO大鼠的物體分辨能力，以物體分辨指數(shù)(discrimination index, DI)為檢測指標，反映大鼠胼胝體部位相關的空間記憶能力，從而反映大鼠的認知能力。給藥結束后(造模后43 d)進行新物體識別實驗行為學測試，參照Ma等[10]的實驗方法，主要分為3個階段進行實驗。具體操作步驟：第1天為適應期：將大鼠放于均勻光照的正方形木箱中，其尺寸為100 cm ×100 cm×100 cm(長×寬×高),自行適應性活動10 min。第2天為熟悉期：在正方形木箱中放入2個相同的圓柱體(直徑為5 cm，高為5 cm)，圓柱體置于正方形木箱斜對角線的1/3處，將大鼠放于反應箱中自行活動10 min，記錄其在10 min內對每個圓柱體的探索時間(以大鼠的嘴湊近圓柱體<0.5 cm，方向必須對著該圓柱體才計入探索時間，站在圓柱體上等不計入時間)。第3天為識別期：放入新的一個立方體(高為5 cm，直徑為5 cm)替換其中的一個圓柱體，分別記錄大鼠在10 min 內探索圓柱體和立方體的時間。計算各組大鼠第3天的分辨指數(shù)，數(shù)值越大，反映實驗動物空間記憶能力越好。計算公式為：

1.6 磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)檢測方法

各組大鼠(n=3)分別于行為學實驗結束后(造模后47 d)進行小動物核磁掃描。大鼠磁共振檢測在首都醫(yī)科大學實驗中心影像教研室完成。用快速自旋回波脈沖序列進行彌散張量成像(diffusion tensor imaging, DTI)，檢測腦白質胼胝體和視束部位微觀結構的改變。應用MRI-DTI觀察大鼠腦白質紋狀體斷面胼胝體部位軸突與髓鞘結構的改變。大鼠經(jīng)JD醫(yī)用麻醉系統(tǒng)吸入2.5%(體積分數(shù))異氟醚進行麻醉，待麻醉成功后，取俯臥位，頭置于線圈中央，采用7.0T小動物專用核磁掃描儀進行大鼠全腦掃描，維持大鼠體溫在37 ℃。DTI掃描參數(shù)為：TR 18 000 ms，TE 25 ms，MTX128×128，F(xiàn)OV:3 cm×3 cm,t=8 min, 層厚：2 mm。利用Paravision version 5.1軟件獲得分數(shù)各向異性(fractional anisotropy, FA)、表觀擴散系數(shù)(apparent diffusion coefficient,ADC)和3個特征向量(λ1、λ2、λ3)圖。使用Paravision version 5.1軟件，在每只大鼠的FA圖上手動追蹤胼胝體，左右視束作為感興趣區(qū)(region of interesting, ROI)，然后，將感興趣區(qū)移位到軸向擴散系數(shù)(axial diffusion coefficient, AD)和徑向擴散系數(shù)(radial diffusivity coefficient, RD)圖上的相同位置，記錄各項指標。通過將主特征向量和FA圖組合成RGB圖像，生成FA偽彩圖。

1.7 LFB髓鞘染色法

造模后48 d各組大鼠取3只進行灌注取材，腦組織行冠狀位冰凍切片，切片厚度為30 μm。每只大鼠取胼胝體部位腦片3張，每組3只，貼于預先用明膠處理過的載玻片上。待自然晾干后，切片經(jīng)蒸餾水清洗，入0.1%(質量分數(shù))堅牢藍(luxol fast blue, LFB)溶液，于室溫密封浸染24 h。腦片經(jīng)蒸餾水清洗后，95%(質量分數(shù))乙醇-0.05%(質量分數(shù))碳酸鋰水溶液-70%(體積分數(shù))乙醇分色，直至顯微鏡下觀察灰質和白質部位區(qū)分清晰，背景無色為止。用蘇木精-伊紅復染5 min。用30%-50%-70%-90%-100%(體積分數(shù))乙醇梯度脫水，每次10 min，髓鞘呈鮮藍色，核呈深藍色，二甲苯透明，中性樹膠封片。正置顯微鏡下觀察并拍照，對各組LFB染色情況進行評價，評分標準：0級：正常；1級：神經(jīng)纖維結構紊亂；2級：明顯空泡形成；3級：有髓神經(jīng)纖維消失。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 EF對2VO模型大鼠學習記憶能力的影響

組間大鼠物體分辨指數(shù)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較結果顯示，與sham組相比，model組的分辨指數(shù)顯著下降(P<0.05)，與model組相比，EF各劑量及陽性藥組分辨指數(shù)均顯著升高(P<0.05,圖1)。

圖1 EF對2VO模型大鼠物體識別實驗物體分辨指數(shù)的影響Fig.1 Effects of EF on discrimination index in new object recognition test of 2VO rats #P<0.05 vs sham group;*P<0.05，**P<0.01 vs model group. EF:epimedium flavonoids; 2VO: permanent bilateral common carotid artery ligation; EF(L): epimedium flavonoids 100 mg/kg; EF(H): epimedium flavonoids 200 mg/kg; Nim: nimodipine.

2.2 EF對2VO模型大鼠胼胝體部位DTI參數(shù)變化的影響

各組大鼠間胼胝體部位FA、RD值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ADC、AD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2)。兩兩比較顯示，與假手術組相比，與模型組相比，EF高劑量(200 mg/kg)組大鼠胼胝體部位FA值明顯升高(P<0.05)，RD值顯著降低(P<0.05)。EF給藥6周能夠減輕腦缺血致胼胝體部位白質纖維束損傷。

圖2 EF給藥對2VO模型大鼠胼胝體部位DTI參數(shù)的影響Fig.2 Effects of EF on white matter fiber bundles in corpus callosum of 2VO rats detected by MRI-DTIA: color-coded FA images in the corpus callosum section at bregma 0.26 mm, B: quantitative analysis of FA； C: quanlitative ADC; D: analysis of AD; E: analysis of RD in the corpus callosum. n=6. #P<0.05, ##P<0.01 vs sham group; *P<0.05 vs model group; EF：epimedium flavonoids; MRI: magnetic resonance imaging; DTI: diffusion tensor imaging; FA: fractional anisotropy; ADC: apparent diffusion coefficient; AD: axial diffusion coefficient; RD: radial diffusivity; 2VO: permanent bilateral common carotid artery ligation; EF(L): epimedium flavonoids 100 mg/kg; EF(H): epimedium flavonoids 200 mg/kg; Nim: nimodipine.

2.3 EF對2VO模型大鼠視束部位DTI參數(shù)變化的影響

各組大鼠間視束部位FA、 ADC、AD、RD值差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，EF給藥與模型組相比，EF高劑量(200 mg/kg)治療組大鼠視束部位FA值顯著升高(P<0.01)，RD值顯著降低(P<0.05)。EF低、高劑量(100、200 mg/kg)治療組ADC、AD值明顯降低(P<0.05，圖3)。EF給藥6周能夠減輕腦缺血致視束部位白質纖維束損傷。

圖3 EF給藥對2VO模型大鼠視束部位DTI參數(shù)的影響Fig.3 Effects of EF on white matter fiber bundles in corpus callosum of 2VO rats detected by MRI-DTIA: color-coded FA images in the corpus callosum section at bregma -3.14 mm, B: quantitative analysis of FA； C: quanlitative ADC; D: analysis of AD; E: analysis of RD in the corpus callosum. n=6. #P<0.05 vs sham group；*P<0.05, **P<0.01 vs model group. EF：epimedium flavonoids; 2VO: permanent bilateral common carotid artery ligation; MRI: magnetic resonance imaging; DTI: diffusion tensor imaging; FA: fractional anisotropy; ADC: apparent diffusion coefficient; AD: axial diffusion coefficient; RD: radial diffusivity; EF(L): epimedium flavonoids 100 mg/kg; EF(H): epimedium flavonoids 200 mg/kg; Nim: nimodipine.

2.4 EF對2VO模型大鼠胼胝體部位髓鞘變化的影響(LFB染色)

各組大鼠間胼胝體部位著色程度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，與假手術組相比，模型組大鼠胼胝體部位著色程度顯著減低，髓鞘結構紊亂明顯。與模型組相比，EF高劑量 (200 mg/kg) 給藥組能夠明顯增加2VO大鼠胼胝體部位的著色程度，髓鞘紊亂減輕 (圖4A)。通過對髓鞘紊亂分級進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠髓鞘紊亂分級值明顯增高 (P<0.01),給予EF高劑量能夠顯著降低模型大鼠的髓鞘紊亂分級值 (P<0.05，圖4B)。

圖4 EF給藥對2VO模型大鼠胼胝體部位髓鞘變化的影響(LFB染色)Fig.4 Effects of EF on demyelination in the corpus callosum of 2VO rats (LFB staining)A: representative images of brain sections stained with LFB (scale bar=50 μm); B: quantitative analysis of grading score for LFB-stained sections. ##P<0.01 vs sham group, *P<0.05 vs model group. EF：epimedium flavonoids;2VO: permanent bilateral common carotid artery ligation; LFB: luxol fast blue; EF(L): epimedium flavonoids 100 mg/kg; EF(H): epimedium flavonoids 200 mg/kg; Nim: nimodipine.

3 討論

本研究主要采用2VO模型模擬CSVD的慢性腦缺血低灌注病理狀態(tài)，給藥6周后采用新物體識別實驗檢測各組大鼠學習記憶功能的變化。新物體識別實驗是利用嚙齒類動物喜歡探索新物體的習性來判斷動物是否能夠辨別新舊物體的行為學方法，被廣泛應用于與認知障礙有關疾病動物模型的評價中，包括CSVD、神經(jīng)退行性疾病、腦損傷模型等多個方面[10-11]。對新物體的偏愛用“分辨指數(shù)”指標進行量化，分辨指數(shù)高，則空間識別記憶能力好。本研究中，與sham組相比，2VO模型大鼠的分辨指數(shù)顯著下降，各給藥組均能升高模型組大鼠的分辨指數(shù)，表明EF可改善2VO模型大鼠的空間工作記憶及物體識別認知能力。2VO術后24 h開始連續(xù)6周給予EF治療，可明顯改善慢性腦灌流不足引起的學習記憶障礙，提示EF有可能改善CSVD患者的臨床癥狀。

腦白質損傷是可在腦內觀察到的CSVD最常見、最早的組織損害，被認為在CSVD損傷中起關鍵作用[5]。腦白質纖維在連接各腦區(qū)功能中起著非常重要的作用，各腦區(qū)之間功能連接異?？蓪е聦W習工作記憶障礙的發(fā)生[12]。DTI是MRI的一種特殊形式，能夠對活體腦內的白質纖維結構進行非侵入性檢測。常用的DTI參數(shù)包括： FA、ADC、AD、RD，這些指標被用來評估缺血后腦白質和灰質的神經(jīng)元壞死、軸突斷開和髓鞘降解情況[13-14]。其中，F(xiàn)A代表白質纖維完整性，并用于確定軸突的密度、分布和方向一致性，是檢測腦損傷后白質纖維完整性最敏感的DTI參數(shù)之一[15]，其變化反映了腦白質微觀結構完整性的改變。目前在許多動物模型中都發(fā)現(xiàn)FA減少，例如新生大鼠缺氧、缺血[16]，以及雙環(huán)己酮草酰二腙小鼠模型[17]等。ADC與神經(jīng)元丟失和白質髓鞘脫失有關[18]。AD代表軸突損傷，其與軸突腫脹和神經(jīng)絲功能障礙有關[19]。RD代表脫髓鞘情況，多項研究[20-21]表明RD增加是髓鞘損傷的特異性標志。AD和RD分別表征特定于軸突和髓鞘的白質變化，增加的AD反映軸突的結構破壞，而增強的RD與缺血后廣泛的髓鞘降解有關[22]。

本研究應用MRI-DTI檢測各組大鼠腦白質胼胝體及視束部位FA、ADC、AD和RD值的變化，以評估EF對2VO模型大鼠腦白質纖維束的影響。結果提示EF可提高2VO大鼠術后6周的FA值，降低ADC值、AD值和RD值，提示EF可減輕腦白質的微結構損傷, 有較強的保護神經(jīng)纖維完整性作用。同時采用堅牢藍(luxol fast blue, LFB)染色對各組大鼠進行組織學評估，以驗證DTI檢測結果。LFB屬于銅-酞菁染料，在乙醇溶液中具有與髓鞘磷脂結合的染色特性。應用LFB髓鞘染色可以很好地顯示出神經(jīng)組織的髓鞘結構。同樣，本研究在LFB染色中也觀察到2VO模型組大鼠胼胝體部位神經(jīng)纖維結構紊亂，髓鞘排列疏松，有部分松解，且有明顯空泡形成。EF給藥可明顯減輕髓鞘結構紊亂，減輕白質損傷。

綜上所述，EF能夠改善2VO模型大鼠胼胝體和視束部位髓鞘和軸突微觀結構的損傷，減輕髓鞘的脫失及紊亂，改善慢性腦缺血低灌注引起的腦白質脫髓鞘病變，進而改善CSVD認知功能障礙。