孟 歡 王 爽 何超男 韓 瑩 潘美晨 殷商啟 鄭 梅 金方方 王雅杰

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢驗科，北京 100015)

獲得性免疫缺陷綜合征是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，當(dāng)疾病進(jìn)展至晚期常因嚴(yán)重免疫缺陷而合并多種機(jī)會性感染[1]。人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒β亞科，是皰疹病毒中最大的病毒，人體感染后大多呈現(xiàn)潛伏/無癥狀感染[2-3]，免疫力低下人群如獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)患者感染后易進(jìn)展為HCMV終末器官疾病，在尸檢中大約90%的AIDS患者存在播散性HCMV感染[4]。由于AIDS患者的免疫功能低下，感染HCMV后，早期無明顯臨床癥狀，不易診斷。因此，對AIDS患者是否感染HCMV的早期篩查尤為重要。

實時熒光核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)(simultaneous amplification and testing，SAT)可利用反轉(zhuǎn)錄酶以及T7 RNA聚合酶對靶標(biāo)RNA進(jìn)行高效擴(kuò)增，其優(yōu)勢在于靶標(biāo)是RNA，在感染初期拷貝數(shù)大于DNA，靈敏度更高；RNA在病原體死亡后降解快，可以區(qū)分活動性感染和非活動性感染，可以用于評估療效；擴(kuò)增產(chǎn)物是RNA，易降解，不易造成實驗室污染[5]。HCMV基質(zhì)表層蛋白pp67(phosphoprotein67, pp67) mRNA是晚期mRNA編碼的HCMV基質(zhì)表層蛋白核酸形式，該mRNA是真正晚期mRNA，可反映活動性HCMV感染[6]，可作為準(zhǔn)確判斷活動性HCMV感染的指標(biāo)，對于降低HCMV病的發(fā)生率和病死率都有重要意義。故本研究擬采用SAT技術(shù)檢測HCMV pp67 mRNA，并評估該方法及該指標(biāo)在臨床應(yīng)用中的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2019年7月至2020年2月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院接受巨細(xì)胞病毒DNA定量檢測的302例患者，其中HIV陽性HCMV活動性感染患者69例、HIV陽性HCMV非活動性/潛伏感染154例、HIV陰性HCMV 非活動性/潛伏感染 79例。樣本類型包括血清、腦脊液、肺泡灌洗液。

入組標(biāo)準(zhǔn)[7-8]：

(1)HIV陽性患者：HIV抗體初篩及確證試驗均為陽性的患者。

(2)HIV陰性患者：HIV抗體初篩試驗陰性且流行病學(xué)調(diào)查排除HIV陽性暴露可能性。

(3)HCMV活動性感染：①抗HCMV特異性抗體IgG(immunoglobulin G, IgG)陽性；②抗HCMV特異性抗體IgM(immunoglobulin M, IgM)陽性且有相應(yīng)器官/部位巨細(xì)胞病毒感染的特征性臨床表現(xiàn)；③HCMV DNA陽性且有相應(yīng)器官/部位巨細(xì)胞病毒感染的特征性臨床表現(xiàn)。同時滿足①、②或①、③兩點或三點都滿足即可診斷為HCMV活動性感染。

(4)HCMV非活動性/潛伏感染：①抗HCMV特異性抗體IgG陽性；②無相應(yīng)器官/部位巨細(xì)胞病毒感染的特征性臨床表現(xiàn)。同時滿足①、②兩點可診斷為HCMV非活動性/潛伏感染。

1.2 SAT 法建立

1.2.1 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、酶反應(yīng)液(M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA聚合酶)、樣品提取液均由上海仁度公司提供。

1.2.2 SAT法反應(yīng)條件

PCR循環(huán)設(shè)置：42 ℃ 1 min，40個循環(huán)。儀器為上海仁度全自動核酸分析系統(tǒng)(Auto SAT)。

1.2.3 結(jié)果判讀

dt(detection time)為樣本曲線與閾值交點的橫坐標(biāo)讀數(shù)。陽性(0

1.2.4 SAT法檢測HCMV pp67 mRNA性能評估

分析性能評估：檢出限、重復(fù)性、特異性的評估均參照2019年《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》[9]、《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》[10]和2019年《臨床化學(xué)定量檢驗程序性能驗證指南》[11]中要求設(shè)計。

(1)檢測下限評估：將濃度為1010copies/mL的HCMV 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成500、400、300 copies/mL，每個濃度重復(fù)檢測25次，計算陽性檢出率。陽性檢出率=(實際檢出次數(shù)/重復(fù)檢測總次數(shù))×100%，0

(2)重復(fù)性評估：將濃度為1010copies/mL的HCMV 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至4.0×103、4.0×104、4.0×105copies/mL 3個濃度后，每個濃度重復(fù)測量20次，計算變異系數(shù)(coefficient of variance,CV)值。判定標(biāo)準(zhǔn)：滿足試劑廠家性能標(biāo)準(zhǔn)，CV<10%。

(3)特異性評估:收集甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)陽性血漿樣本、HIV-1陽性血漿樣本、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)陽性血清樣本、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)陽性血清樣本、人類皰疹病毒3型(human herpes virus-3, HHV-3)陽性全血樣本、單純皰疹病毒2型(herpes simplex virus-2, HSV-2)陽性陰道拭子樣本、腸道病毒陽性肛拭子樣本；對樣本進(jìn)行病毒定量，定量后稀釋至如下濃度：HAV1 000 IU/mL、HBV 100 000 IU/mL、HCV 100 000 IU/mL、HIV-1 1 000 IU/mL、HHV-3 100 000 copies/mL、HSV-2 100 000 copies/mL和腸道病毒 100 000 copies/mL，將稀釋后的樣本加入到HCMV陰性樣本中，進(jìn)行HCMV pp67 mRNA檢測，每個樣本檢測2次。檢測結(jié)果均為陰性則判定為特異性符合臨床要求。

1.3 實驗室檢測指標(biāo)及方法

(1)HCMV DNA定量檢測：采用PCR-熒光定量方法檢測試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因)檢測血清、肺泡灌洗液、腦脊液樣本中的HCMV DNA，儀器為Applied Biosystems 7500型定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；檢測結(jié)果≥500 copies/mL為陽性，<500 copies/mL為未檢測到。

(2)抗HCMV IgG、 IgM特異性抗體檢測：采用電化學(xué)發(fā)光法檢測患者血清中抗HCMV IgG(人巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測試劑盒購自德國Roche公司)和IgM(人巨細(xì)胞病毒IgM抗體檢測試劑盒購自德國Roche公司)特異性抗體，Cobas E602 電化學(xué)發(fā)光分析儀購自德國羅氏公司。

(3)HIV-1核糖核酸 (RNA)定量檢測：采用聚合酶鏈反應(yīng)熒光法檢測HIV (Ⅰ型) 核酸[HIV(Ⅰ型) 核酸定量檢測試劑盒購自瑞士Roche公司], 儀器為瑞士羅氏cobasAmpliPrep/cobas TaqMan病毒載量檢測系統(tǒng)。

(4)T淋巴細(xì)胞亞群絕對計數(shù)：采用美國BD公司FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀及其配套試劑檢測。

(5)總蛋白、白蛋白檢測：采用日本HITACHI 7600全自動生化分析儀及北京利德曼生化股份有限公司試劑進(jìn)行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 研究對象的臨床特征

在302例患者中，HIV陽性HCMV活動性感染組、HIV陽性HCMV非活動性/潛伏感染組以及HIV陰性HCMV 非活動性/潛伏感染組的平均年齡和性別分布，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 研究對象的臨床特征

2.2 SAT法性能評估結(jié)果

2.2.1 檢測下限評估

表2結(jié)果顯示，500、400 copies/mL的HCMV 標(biāo)準(zhǔn)品的檢出率均為100%，而300 copies/mL的HCMV標(biāo)準(zhǔn)品的檢出率為80%，故檢出下限為400 copies/mL。

表2 檢出下限性能驗證結(jié)果

續(xù)表2

2.2.2 重復(fù)性評估

3個濃度的重復(fù)性評估CV值均小于10%，詳見表3。

表3 重復(fù)性驗證結(jié)果

2.2.3 特異性評估

表4檢測結(jié)果顯示均為陰性，證明該試劑的特異性符合標(biāo)準(zhǔn)。

表4 特異性驗證結(jié)果

2.3 不同指標(biāo)檢測HCMV結(jié)果及檢驗效能評價

2.3.1 不同指標(biāo)檢測HCMV結(jié)果

將302例患者的血清樣本分別用于檢測抗HCMV特異性IgG抗體、抗HCMV特異性IgM抗體；血清、肺泡灌洗液、腦脊液樣本用于HCMV DNA和HCMV pp67 mRNA的檢測，其中同一患者在同一時間段內(nèi)(樣本送檢間隔時間小于7 d)的不同類型樣本，只要當(dāng)中某一種樣本檢測出陽性結(jié)果，則視該患者為HCMV DNA陽性病例或HCMV pp67 mRNA陽性病例。3組患者中，抗HCMV特異性IgG抗體陽性率為100%，HIV+HCMV活動性感染組、HIV+ HCMV非活動性/潛伏感染組和HIV- HCMV非活動性/潛伏感染組的抗HCMV特異性IgM抗體陽性率分別為13.04%、0.08%和0.07%；HCMV DNA陽性率分別為86.96%、30.52%和0%；HCMV pp67 mRNA陽性率分別為60.87%、18.83%和0%。結(jié)果詳見表5。

表5 不同指標(biāo)檢測HCMV結(jié)果Tab.5 Results of different indicators used in HCMV detection

2.3.2 3種檢測指標(biāo)的檢驗效能比較

根據(jù)入組標(biāo)準(zhǔn)，將3組人群合并為兩大組分別為HCMV活動性感染組、HCMV非活動性/潛伏感染組，計算HCMV DNA、HCMV pp67 mRNA、抗HCMV 特異性IgM抗體3種指標(biāo)的特異度、靈敏度、陽性預(yù)測值(positive predictive value, PPV)、陰性預(yù)測值(negative predictive value, NPV)，正確率以及約登指數(shù)(Youden index, YI)。3種檢測指標(biāo)中，抗HCMV 特異性IgM抗體特異度最高為91.85%，HCMV DNA靈敏度最高為86.96%，HCMV DNA和HCMV pp67 mRNA的PPV接近，分別為0.56和0.59，3種指標(biāo)的NPV由高到低分別為HCMV DNA 0.95, HCMV pp67 mRNA 0.88以及抗HCMV IgM 0.78；HCMV DNA和HCMV pp67 mRNA的正確率相同都為81.46%，抗HCMV IgM的正確率稍低為73.84%；3種檢測指標(biāo)中HCMV DNA的約登指數(shù)最高為0.67，其次為HCMV pp67 mRNA 0.48, 而抗HCMV IgM的約登指數(shù)僅為0.04。檢驗效能HCMV DNA大于HCMV pp67 mRNA大于抗HCMV IgM。結(jié)果詳見表6。

表6 不同指標(biāo)診斷HCMV活動性感染的檢驗效能

2.3.3 SAT法與臨床診斷陽性檢出率比較

將HCMV pp67 mRNA的陽性檢出率與臨床診斷結(jié)果作比較，結(jié)果顯示SAT法檢測HCMV pp67 mRNA的陽性檢出率與臨床診斷的陽性檢出率相比，P=0.894, 兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果表明兩者的陽性檢出率相近。詳見表7。

表7 STA法HCMV pp67 mRNA陽性檢出率與臨床診斷結(jié)果比較

2.4 HCMV pp67 mRNA結(jié)果與其他臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)

從2.3的結(jié)果顯示出SAT法檢測HCMV pp67 mRNA的檢驗效能適中，陽性檢出率與臨床診斷差異無統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)HCMV pp67 mRNA結(jié)果陽性與否，HIV陽性與否，將患者重新分為HIV+ HCMV pp67 mRNA+組、HIV+ HCMV pp67 mRNA-組以及HIV- HCMV pp67 mRNA-組，分別比較3組患者的T淋巴細(xì)胞亞群和生物化學(xué)指標(biāo)，以及HIV+的兩組患者的HIV載量。

2.4.1 HIV+患者HCMV pp67 mRNA陽性組與陰性組HIV載量(log值)比較

根據(jù)表8、圖1結(jié)果可知，HCMV pp67 mRNA陽性組患者的HIV載量要高于HCMV pp67 mRNA陰性組(P=0.003)，血中HIV載量高的患者HCMV活動性感染的概率更大。

圖1 HIV+患者中HCMV pp67 mRNA陽性組與HCMV pp67 mRNA陰性組HIV載量比較Fig.1 Comparison of HIV load between HCMV pp67 mRNA positive group and HCMV pp67 mRNA negative group in HIV+patients** P<0.01； HIV: human immunodeficiency virus; HCMV: human cytomegalovirus； pp67： phosphoprotein67.

表8 HIV+患者中HCMV pp67 mRNA陽性組與HCMV pp67 mRNA陰性組HIV載量比較

2.4.2 3組患者T淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)的差異比較

經(jīng)過比較，三組患者的CD45+淋巴細(xì)胞(CD45+lymphocyte, CD45+)計數(shù)、CD3+T淋巴細(xì)胞(CD3+T lymphocyte, CD3+)計數(shù)、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+T lymphocyte, CD3+CD8+)計數(shù)、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞與CD45+淋巴細(xì)胞的比值(CD3+CD4+lymphocyte/CD45+lymphocyte，CD3+CD4+/CD45+)、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+T lymphocyte, CD3+CD4+)計數(shù)、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞與CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的比(CD3+CD4+/CD3+CD8+),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果詳見表9。組間兩兩比較可知，表中各指標(biāo)除CD3+CD8+ T淋巴細(xì)胞計數(shù)外，HIV+組均低于HIV-組；表中各指標(biāo)組間兩兩比較結(jié)果中，HIV+ HCMV pp67 mRNA+組均要低于HIV+ HCMV pp67mRNA-組，結(jié)果提示免疫能力越差，HCMV活動性感染的可能性越高。組間比較結(jié)果詳見圖2。

圖2 3組患者T淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)差異比較Fig.2 The difference of T lymphocyte subsets count in the three groupsA：CD45+ lymphocyte counts; B：CD3+ T lymphocyte counts; C： CD3+CD4+T lymphocyte counts; D：CD3+CD8+ T lymphocyte counts; E：CD3+CD4+ T lympocyte to CD3+CD8+ T lymphocyte ratio;F： CD3+CD4+ T lymphocyte to CD45+ lymphocyte ratio; *P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001; HIV: human immunodeficiency virus; pp67： phosphoprotein67.

表9 不同組之間T淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)的差異

2.4.3 3組患者血漿白蛋白、白球比的差異比較

3組患者中，HIV+ HCMV pp67 mRNA+組患者血漿白蛋白數(shù)量以及白球比均要低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表10和圖3。

表10 不同組之間ALB和A/G的差異

圖3 3組患者血漿白蛋白、白球比的差異比較Fig.3 Comparison of plasma albumin, albumin globule ratio in the three groupA: albumin quantity; B: albumin to globulin ratio;*P<0.05， ** P<0.01，***P<0.001； ALB： albumin； A/G： albumin globule ratio; HIV: human immunodeficiency virus; pp67： phosphoprotein67.

3 討論

HIV患者共感染HCMV后，因其自身免疫低下，體內(nèi)潛伏感染的HCMV易發(fā)展為活動性感染，導(dǎo)致HCMV終末器官疾病，主要表現(xiàn)為巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎，還可累及肺、腸道、腎上腺、腦等器官，HCMV也可通過血液造成播散性感染[12]。因此，良好的指標(biāo)和方法輔助診斷HCMV活動性感染對于HIV患者的預(yù)后和免疫重建有重要意義。

SAT法檢測HCMV pp67 mRNA的各項性能驗證結(jié)果均達(dá)到臨床檢測要求，該方法可以用于臨床樣本的檢測；在檢驗效能比較中，HCMV DNA的靈敏度、正確診斷指數(shù)(即約登指數(shù))在3個指標(biāo)中最高，但HCMV DNA檢測存在局限性，HCMV DNA陽性不能用于辨別患者是否處于活動性感染[13]；抗HCMV特異性IgM抗體的特異度雖達(dá)到91.85%，但這可能是由于HIV患者免疫低下，患者無法產(chǎn)生足量的抗體，從而導(dǎo)致抗HCMV特異性IgM抗體結(jié)果假陰性[14]。SAT法檢測HCMV pp67 mRNA的檢驗效能適中，且與臨床診斷結(jié)果比較，能較好地分辨患者是否處于現(xiàn)癥感染，有良好的輔助診斷價值。

HCMV pp67 mRNA陽性的HIV患者其自身的免疫功能較差，HIV載量較高；和其他兩組比，HCMV pp67 mRNA陽性組血漿白蛋白更少，有研究[15-16]顯示白蛋白可以與抗反轉(zhuǎn)錄病毒的藥物非特異性結(jié)合，對于維持血藥濃度以及藥物作用時間有一定意義，低白蛋白血癥可能與抗病毒治療失敗有關(guān)。從以上兩點可得，免疫重建失敗，抗病毒治療失敗的HIV患者更易使HCMV潛伏感染激活或重新感染HCMV；此外，也有研究[17]表明，HCMV感染人體后會引起免疫抑制，這也可能進(jìn)一步導(dǎo)致HIV患者免疫重建困難，從而更易誘發(fā)機(jī)會性感染。

綜上，SAT法檢測HCMV pp67 mRNA可以用于臨床輔助診斷HCMV活動性感染，也可輔助評估HIV患者免疫重建、抗病毒治療的效果；HCMV pp67 mRNA陽性患者建議監(jiān)測白蛋白濃度以及免疫重建、抗病毒治療的療效。