徐春燕，莊之棟，馬 超，劉 勇，沈長春，蔡建堤，謝少卿

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

魚類早期個(gè)體(包括魚卵、仔稚魚)發(fā)育過程是魚類生命周期中非常短暫、形態(tài)學(xué)和生理學(xué)等特征變化明顯的過渡時(shí)期[1]，魚卵和仔稚魚調(diào)查研究是魚類生態(tài)學(xué)以及魚類生活史研究的一部分，同時(shí)也是魚類資源調(diào)查、早期補(bǔ)充機(jī)制和種群數(shù)量變動(dòng)、漁業(yè)資源可持續(xù)利用等研究的重要基礎(chǔ)[1-2]。目前，魚卵和仔稚魚種類的鑒定多是根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)別，但由于個(gè)體較小、用于鑒別的形態(tài)特征較少，不同種類很難進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。與已知的成魚種類相比，已鑒別的魚卵和仔稚魚種類少之又少，魚類早期生活史的相關(guān)研究相對滯后，相關(guān)形態(tài)學(xué)資料和圖集十分有限，嚴(yán)重限制了鑒定工作的開展；另外國內(nèi)缺少相關(guān)的分類學(xué)家，鑒定者的水平不一，很難保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性[3-5]。

2003年，加拿大分類學(xué)家Hebert P D N[6]首次提出DNA條形碼的概念，此后，DNA條形碼技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物、植物及海洋生物的種類鑒定[7-9]。DNA條形碼技術(shù)利用DNA序列對物種進(jìn)行鑒定，突破了傳統(tǒng)分類學(xué)只能依靠外部形態(tài)特征鑒定物種的限制，對產(chǎn)卵場相互交疊和產(chǎn)卵期相互交錯(cuò)、形態(tài)特征近似、形態(tài)學(xué)分類困難的魚類早期個(gè)體種類的分類以及形態(tài)學(xué)分類上存有疑問的種類的驗(yàn)證提供了新的方法和手段[1]。線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(Cytochrome C oxidase subunit I，COI)基因是魚類常用的條形碼基因，被廣泛應(yīng)用于物種鑒定和多樣性分析[7，10-12]。然而，目前有研究指出單一的COI基因并不適用于所有魚類物種的鑒別[13]，結(jié)合其他條形碼基因相互參照和驗(yàn)證是確保條形碼技術(shù)鑒定準(zhǔn)確性的必要手段[7，14-15]。

本研究選取應(yīng)用比較廣泛的COI和16S rRNA基因，對廈門海域采集的仔稚魚樣品進(jìn)行種類鑒定，通過分析遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，探究其在仔稚魚種類鑒定中的適用性，同時(shí)可以為仔稚魚的準(zhǔn)確鑒定和分類學(xué)研究提供依據(jù)和基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與形態(tài)學(xué)鑒定

在廈門海域設(shè)置12個(gè)采樣站位(圖1)，分別于2019年4月22日和2020年9月14日采集仔稚魚樣品。參照GB/T 12763.6—2007《海洋調(diào)查規(guī)范 第6部分：海洋生物調(diào)查》[16]，利用大型浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)口內(nèi)徑80 cm，網(wǎng)長280 cm，孔徑0.505 mm)進(jìn)行水平拖網(wǎng)采樣，樣品用95%酒精現(xiàn)場固定，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。

采集到的仔稚魚樣品首先在奧林巴斯SZX7體視顯微鏡下根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行鑒定和形態(tài)學(xué)歸類，參照Okiyama M的《An Atlas of the Early Stage Fishes in Japan》[17]及張仁齋等的《中國近海魚卵與仔魚》[2]進(jìn)行鑒定，之后根據(jù)初步的鑒定結(jié)果，每一種選取代表性個(gè)體進(jìn)行基于COI和16S rRNA基因的DNA條形碼分析。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

選取的仔稚魚樣品用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒進(jìn)行DNA提取，DNA樣品置于4℃保存?zhèn)溆谩OI基因序列擴(kuò)增采用通用引物[18]，F(xiàn)ish F1：5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′，F(xiàn)ish R1：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′；16S rRNA基因序列擴(kuò)增采用通用引物[19]，16S AR：5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′，16S BR：5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′。

PCR反應(yīng)體系：2.5 μL 10×buffer，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，正反引物(10 μmol/L)各1 μL ，0.2 μL Taq酶，DNA模板1 μL，超純水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性60 s，50℃退火50 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，選取擴(kuò)增效果好的PCR產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行雙向測序。

1.3 序列分析

測序獲得的序列首先利用Chromas 2.6.5軟件查看原始序列質(zhì)量，質(zhì)量好的序列利用Seqman軟件進(jìn)行雙向拼接。將拼接所得COI和16S rRNA基因序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站進(jìn)行比對，COI基因同時(shí)可以在BOLD(Barcode of Life Database)進(jìn)行比對。比對后分別根據(jù)相似度進(jìn)行種類鑒定，與庫中物種序列相似度≥99%的即鑒定為同一個(gè)種，92%～99%之間的鑒定為同一屬，85%～92%之間的鑒定為同一科[4]，另外，兩種基因鑒定結(jié)果一致時(shí)，最終將此種鑒定為一個(gè)物種，結(jié)果不一致時(shí)，則將其鑒定到科或?qū)?。鑒定后相關(guān)序列及信息遞交至GenBank獲取序列號。兩種基因分別用MEGAX軟件中Clustal W程序進(jìn)行多重比對，比對后去除兩端冗余序列，保留共有序列區(qū)域進(jìn)行后續(xù)分析，統(tǒng)計(jì)序列的長度、堿基組成、保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)、單突變位點(diǎn)，種內(nèi)和種間遺傳距離基于Kimura-2-parameter雙參數(shù)模型(K2P)進(jìn)行計(jì)算，分子系統(tǒng)進(jìn)化樹利用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建，以Bootstrap 1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)其分支置信度[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果及序列分析

本研究共選取80尾仔稚魚樣品分別進(jìn)行COI和16S rRNA基因的條形碼分析，由于在DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序過程中，均有可能出現(xiàn)結(jié)果不佳的情況，最終獲得64條COI基因序列和74條16S rRNA基因序列。COI基因序列平均長度655 bp，16S rRNA基因序列平均長度575 bp，序列均遞交至GenBank獲取序列號，序列號見表1。

COI基因序列的平均堿基組成為T：30.4%、C：28.0%、A：23.4%、G：18.2%，A+T含量(53.8%)高于G+C含量(46.2%)，符合多數(shù)魚類COI序列的堿基組成特征。各密碼子堿基組成表現(xiàn)出明顯的差異性，第2個(gè)密碼子平均GC含量最高，為56.5%；第3密碼子次之，平均為42.7%；第1密碼子平均GC含量最低，為39.5%。全部位點(diǎn)中包括保守位點(diǎn)379個(gè)、變異位點(diǎn)276個(gè)、簡約信息位點(diǎn)265個(gè)、單突變位點(diǎn)11個(gè)。

16S rRNA基因序列的平均堿基組成為T：22.9%、C：25.4%、A：28.6%、G：23.1%，A+T含量(51.5%)高于G+C含量(48.5%)，與多數(shù)魚類線粒體DNA的堿基組成特征一致。各密碼子堿基組成表現(xiàn)出明顯的差異性，第1個(gè)密碼子平均GC含量最高，為54.8%；第3密碼子次之，平均為45.7%；第2密碼子平均GC含量最低，為44.9%。全部位點(diǎn)中包括保守位點(diǎn)301個(gè)、變異位點(diǎn)298個(gè)、簡約信息位點(diǎn)278個(gè)、單突變位點(diǎn)20個(gè)。

2.2 序列比對及仔稚魚種類鑒定

所得COI基因同時(shí)在NCBI和BOLD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，16S rRNA基因在NCBI比對，比對后依據(jù)相似度進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見表1。COI基因?qū)⒆兄婶~樣品鑒定為26個(gè)種類，其中19個(gè)種類鑒定到種、6個(gè)鑒定到屬、1個(gè)種類僅鑒定到科；16S rRNA基因?qū)⒆兄婶~樣品鑒定為29個(gè)種類，其中23個(gè)種類鑒定到種、6個(gè)鑒定到屬。

表1 基于COI和16S rRNA基因鑒定的廈門海域仔稚魚

兩種基因鑒定結(jié)果基本一致，僅有三處存在分歧。COI基因鑒定為鯡形目sp.(Clupeiformes sp.)的種類，在NCBI和BOLD中與潔白鯡(Escualosathoracata)和印度小公魚(Stolephorusindicus)相似性均≥99%，不能確定具體為哪一個(gè)種類，僅將其鑒定到鯡形目sp.；而NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有印度小公魚16S rRNA基因，所以此種16S rRNA基因的比對結(jié)果僅與潔白鯡相似性≥99%，將其鑒定為潔白鯡；兩種基因比對鑒定結(jié)果不同，本研究僅將其鑒定為鯡形目sp.。COI基因鑒定為小沙丁魚屬sp.(Sardinellasp.)的種類， 在NCBI和BOLD中與黑尾小沙丁魚(S.melanura)、 白腹小沙丁魚(S.albella)、 纟遂鱗小沙丁魚(S.fimbriata)和多耙小沙丁魚(S.jussieui)相似性均大于99%， 無法確定為哪一個(gè)種類， 僅鑒定到小沙丁魚屬sp.； 而其16S rRNA基因僅與纟遂鱗小沙丁魚相似性大于99%， 其余小沙丁魚屬種類相似性均低于99%， 將其鑒定為纟遂鱗小沙丁魚；本研究將其鑒定為小沙丁魚屬sp.。 COI基因鑒定為小公魚屬sp.(Stolephorussp.)的種類， 在NCBI和BOLD中與短背小公魚(S.bataviensis)和江口小公魚(S.commersonnii)相似性均大于99%， 無法確定為哪一個(gè)種類， 僅鑒定到小公魚屬sp.； NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有江口小公魚16S rRNA基因， 所以此種16S rRNA基因的比對結(jié)果僅與短背小公魚相似性≥99%， 將其鑒定為短背小公魚； 本研究將其鑒定為小公魚屬sp.。

續(xù)表1

2.3 遺傳距離

利用MEGAX軟件，基于K2P模型計(jì)算各分類階元的遺傳距離，結(jié)果見表2。

各種類COI基因的種內(nèi)遺傳距離在0～0.005 4之間，平均種內(nèi)遺傳距離為0.001 5(SD=0.001 75)。多個(gè)種類的種內(nèi)遺傳距離為0，褐菖鲉的種內(nèi)遺傳距離最大。同屬不同物種間遺傳距離在0.085 1～0.238 5之間，棘鯛屬的黃鰭鯛和黑棘鯛的種間遺傳距離最小，小公魚屬的青帶小公魚和小公魚屬sp.的種間遺傳距離最大，平均種間遺傳距離為0.197 6(SD=0.048 71)，約為種內(nèi)平均遺傳距離的132倍，符合Hebert P D N等[21]提出的“10×規(guī)則”，即序列的種間遺傳距離大于平均種內(nèi)遺傳距離的10倍以上時(shí)才能有效鑒別物種。同科不同屬的僅魚箴科的異鱗魚箴屬和下魚箴屬，屬間遺傳距離為0.216 4。目內(nèi)科間遺傳距離最小值出現(xiàn)在鱸形目彈涂魚科和蝦虎魚科，為0.153 1；最大值出現(xiàn)在鱸形目羊魚科和魚喜科，為0.269 7；平均科間遺傳距離為0.238 7(SD=0.018 24)。

16S rRNA基因種內(nèi)的遺傳距離在0～0.002 0之間，平均為0.000 3(SD=0.000 57)，各種類的種內(nèi)遺傳距離明顯小于其COI序列的遺傳距離。多個(gè)種類的種內(nèi)遺傳距離為0，籃子魚屬sp.的種內(nèi)遺傳距離最大。同屬不同物種間遺傳距離在0.026 6～0.164 7之間，棘鯛屬的棘鯛屬sp.和黑棘鯛的種間遺傳距離最小，肩鰓鳚屬的斑點(diǎn)肩鰓鳚和肩鰓鳚屬sp.的種間遺傳距離最大，平均種間遺傳距離為0.089 2(SD=0.045 42)，同樣超過種內(nèi)平均遺傳距離的10倍以上。同科不同屬的魚箴科的異鱗魚箴屬和下魚箴屬，屬間遺傳距離為0.182 3。目內(nèi)科間遺傳距離最小值同樣出現(xiàn)在鱸形目彈涂魚科和蝦虎魚科，為0.059 1；最大值出現(xiàn)在鱸形目鳚科和銀鱸科，為0.227 5；平均科間遺傳距離為0.162 3(SD=0.033 63)。

由表2可以看出，COI和16S rRNA基因遺傳距離均隨著分類階元的提高而增大，但增幅隨著分類階元的提高越來越小。

表2 不同分類階元遺傳距離

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹

基于64條COI基因序列和74條16S rRNA基因序列分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2、圖3)。由圖可以看出，基于COI和16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果基本一致，在種的水平上，聚類效果清晰，所有物種都分別聚為獨(dú)立的一支從而被有效區(qū)分，同一個(gè)種類的不同個(gè)體也都能聚在同一個(gè)分支。同屬的個(gè)體在基于16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹上聚類效果也很明顯，如棘鯛屬、銀鱸屬、屬、肩鰓鳚屬、小公魚屬的不同種類分別聚為一支，而基于COI基因構(gòu)建的進(jìn)化樹上，肩鰓鳚屬的斑點(diǎn)肩鰓鳚和肩鰓鳚屬sp.并未聚在一支。在科和目的水平上，兩條進(jìn)化樹的聚類效果都不清晰，聚類關(guān)系相互交叉、比較混亂。

3 討論

3.1 COI和16S rRNA基因在仔稚魚種類鑒定中的適用性及在系統(tǒng)進(jìn)化分析中的局限性

Hebert P D N等[22]的研究表明，同一物種內(nèi)的遺傳距離多小于0.020，0.020常作為DNA條形碼物種劃分的閾值，另外指出只有種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離的10倍以上時(shí)才能有效鑒別物種[21]。

本研究各個(gè)種類COI基因的種內(nèi)遺傳距離(0～0.005 4)均小于0.020，同屬種間的遺傳距離(0.085 1～0.238 5)均大于0.020，符合Hebert P D N等提出的種內(nèi)遺傳距離的標(biāo)準(zhǔn)，且種間和種內(nèi)遺傳距離分布范圍沒有交叉，存在明顯的條形碼間隙；平均種間遺傳距離(0.197 6)為種內(nèi)遺傳距離(0.001 5)的約132倍；以上結(jié)果均表明，COI基因可以作為條形碼對仔稚魚進(jìn)行種類鑒定。16S rRNA基因種內(nèi)遺傳距離(0～0.002 0)遠(yuǎn)小于0.020，同屬種間的遺傳距離(0.026 6～0.164 7)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離分布范圍，平均種間遺傳距離(0.089 2)大于平均種內(nèi)遺傳距離(0.000 3)的10倍以上，16S rRNA基因同樣也適合用來進(jìn)行仔稚魚的種類鑒定。另外，基于COI基因和16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹也直觀地反映出兩種基因都能將所有物種區(qū)別開來，印證了兩種基因在仔稚魚種類鑒定中的適用性。

COI和16S rRNA基因在同科屬間及同目科間的遺傳距離的分布范圍存在重疊，對基于COI和16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析也表明，在科和目的水平上，聚類關(guān)系不是很清晰。這說明，COI和16S rRNA基因不適合用來分析種以上高分類階元的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，這與其他諸多研究者的結(jié)論[12，23-24]相一致。

3.2 COI和16S rRNA基因?qū)B門海域仔稚魚的鑒定結(jié)果分析

本研究共選取80尾仔稚魚樣品進(jìn)行DNA提取、COI和16S rRNA基因的擴(kuò)增、測序、序列比對與分析。通過序列比對，COI基因?qū)⒆兄婶~樣品鑒定為26個(gè)種類(4個(gè)種類的樣品PCR擴(kuò)增失敗)，16S rRNA基因?qū)⒆兄婶~樣品鑒定為29個(gè)種類(1個(gè)種類的樣品PCR擴(kuò)增失敗)，總的來說，16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增效率高于COI基因。除去擴(kuò)增失敗的種類，兩種基因的鑒定結(jié)果基本一致，存在分歧的3處，多是由于COI基因比對結(jié)果與多個(gè)近緣種相似而無法確定具體哪個(gè)種類，而NCBI數(shù)據(jù)庫中16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)不足，16S rRNA基因比對結(jié)果僅與其中一個(gè)種類相似性大于99%。目前，DNA條形碼數(shù)據(jù)庫并不全面，尤其是一些非經(jīng)濟(jì)種和少見種的COI和16S rRNA基因序列還十分欠缺。另外，數(shù)據(jù)庫中存在一些錯(cuò)誤鑒定后提交的序列，如果未能加以甄別則會干擾后續(xù)研究者序列的比對和物種鑒定[25]。因此，DNA條形碼基因序列庫的完整和準(zhǔn)確是物種鑒定的前提條件[26]，除不斷補(bǔ)充DNA條形碼數(shù)據(jù)庫外，還必須嚴(yán)格開展序列的審查工作，保證數(shù)據(jù)庫中序列的質(zhì)量，從而更好地發(fā)揮其在物種鑒定中的作用。

本研究中鑒定為鯡形目sp.、小沙丁魚屬sp.、小公魚屬sp.、鲾屬sp.、銀鱸屬sp1.、銀鱸屬sp2.、棘鯛屬sp.、籃子魚屬sp.的種類，經(jīng)COI或16S rRNA基因比對后，均與數(shù)據(jù)庫中多個(gè)種類高度匹配，相似性均大于99%，無法鑒定到種的水平。說明有些魚類不僅形態(tài)上非常相似、無法區(qū)分，序列差異也較小，利用COI或16S rRNA基因均無法準(zhǔn)確鑒定，這也是利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行種類鑒定的難點(diǎn)[27]，針對這種情況，仍需要結(jié)合更多分子標(biāo)記(如線粒體Cytb基因、核基因分子標(biāo)記RAG2等)作進(jìn)一步研究。

綜上所述，COI和16S rRNA基因均可以作為條形碼對形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分的仔稚魚進(jìn)行種類鑒定，兩種基因鑒定結(jié)果基本一致，且多數(shù)能鑒定到種的水平，兩種基因結(jié)合使用可以相互印證或補(bǔ)充，從而提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于本研究采集到的樣品數(shù)量有限，有的種類僅1條序列，相關(guān)數(shù)據(jù)不夠全面，下一步應(yīng)采集更多季節(jié)或月份的仔稚魚樣品，對DNA條形碼技術(shù)在仔稚魚種類鑒定中的應(yīng)用進(jìn)行更充分的研究和探討。