譚曉山，周 迪，李 平，李 俊，楊 蓉，陳光候，王 燕，陳大芳，龍清孟

(貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴州 貴陽(yáng) 550018)

山羊冷凍精液人工授精技術(shù)不僅可以減少本交帶來的疫病傳播風(fēng)險(xiǎn)，還能減少種公羊的飼養(yǎng)數(shù)量，減少飼養(yǎng)成本及引種成本，同時(shí)提高優(yōu)秀種公羊的利用率和資源共享率，解決種羊場(chǎng)之間在地域及使用時(shí)間上的限制，具有良好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。山羊冷凍精液生產(chǎn)的關(guān)鍵在于稀釋液配方及冷凍保護(hù)劑。本試驗(yàn)通過比較4種常用的山羊冷凍精液稀釋液配方和2種冷凍保護(hù)劑對(duì)貴州黑山羊精液品質(zhì)的影響，篩選出適合貴州黑山羊冷凍精液的稀釋液和冷凍保護(hù)劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物選擇體況良好、無(wú)繁殖疾病的2～4歲貴州黑山羊種公羊3～5只作為試驗(yàn)動(dòng)物。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)2018年6月在貴州省冊(cè)亨縣冗渡鎮(zhèn)冗坪肉羊育種與繁殖工程中心及規(guī)?；】蹈咝юB(yǎng)殖示范基地進(jìn)行。

1.3 主要試劑TALP稀釋液、葡萄糖、果糖、檸檬酸鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、青霉素、鏈霉素、考馬斯亮藍(lán)、乙二醇、甘油。

1.4 主要儀器全自動(dòng)精液質(zhì)量分析系統(tǒng)(德國(guó)Minitube AndroVision)、移液器(Eppendorf L23114F)、正置顯微鏡(奧林巴斯CX41)、水浴鍋(HH.S21-4)、17 ℃恒溫箱(FYL-YS-150L)、超聲波細(xì)管封口機(jī)、手提式車載運(yùn)輸箱(FYL-YS-50L)、高壓滅菌鍋(LMQ.C-100E)。

1.5 山羊冷凍精液稀釋液配方根據(jù)國(guó)內(nèi)對(duì)山羊冷凍精液稀釋液配方的研究，選擇4種較理想的配方分為4組，各組選擇2種不同冷凍保護(hù)劑(見表1)。

表1 山羊凍精稀釋液配方及分組

1.6 TALP稀釋液配方 配制TALP稀釋液100 mL：NaCl 654.5 mg，KCl 20 mg，MgCl2·6H2O 10 mg，NaH2PO46.2 mg，NaHCO3210 mg，葡萄糖250 mg，丙酮酸11 mg，乳酸鈉112 mg，HEPES 120 mg。高壓滅菌，使用前加入BSA 6 mg/mL，卡那霉素 7.5 mg/mL，pH值調(diào)至7.6[5]。

1.7 方法

1.7.1 采精于上午11：00左右，氣溫22 ℃以上，通過人工采精方法采集貴州黑山羊精液，并立即進(jìn)行精子活力初步檢測(cè)，將精液移至1.5 mL試管內(nèi)，用棉花覆蓋包裹進(jìn)行保溫，以減少對(duì)精子的刺激，置于17 ℃樣品運(yùn)輸箱(車載冰箱)中保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.7.2 精液檢測(cè)檢測(cè)前先將全自動(dòng)精液質(zhì)量分析系統(tǒng)打開，載物臺(tái)及載玻片等預(yù)熱至37 ℃。將精液用0.9%生理鹽水按照1∶9比例進(jìn)行稀釋后用全自動(dòng)精液質(zhì)量分析系統(tǒng)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.7.3 冷凍精液制作方法

1.7.3.11組(1-1、1-2)與3組(3-1、3-2)按方法1：(1)將精液與 Ⅰ 液按1∶2等溫稀釋(34 ℃)，用12～15層紗布包裹貯精瓶，連同 Ⅱ 液一起放入2～5 ℃冰箱中平衡1.5～2 h。(2)平衡后的精液用 Ⅱ 液等倍稀釋，并裝入0.25 mL細(xì)管后再平衡0.5～1 h。 (3)將液氮倒入完好的泡沫盒中，將細(xì)管架浸入液氮中預(yù)冷至液氮停止沸騰時(shí)提取細(xì)管架，固定于離液氮面2～3 mm的位置，將細(xì)管平放于細(xì)管架上熏蒸2～3 min后浸入液氮中保存。(4)42 ℃水浴解凍10 s后進(jìn)行檢測(cè)。

1.7.3.22組(2-1、2-2)按方法2：(1)在原精中加入3～4倍的Ⅰ液，1 200 r/min離心10 min，去掉上清液后加入Ⅰ液至原精的量。(2)將精液與Ⅰ液按1∶2等溫稀釋(34 ℃)，用12～15層紗布包裹貯精瓶，連同Ⅱ液一起放入2～5 ℃冰箱中平衡1.5～2 h。(3)平衡后的精液用Ⅱ液等倍稀釋，并裝入0.25 mL細(xì)管后再平衡0.5～1 h。(4)將液氮倒入完好的泡沫盒中，將細(xì)管架浸入液氮中預(yù)冷至液氮停止沸騰時(shí)提取細(xì)管架，固定于離液氮面2～3 mm的位置，將細(xì)管平放于細(xì)管架上熏蒸2～3 min后浸入液氮中保存。(5)42 ℃水浴解凍10 s后進(jìn)行檢測(cè)。

1.7.3.34組(4-1、4-2)按方法3：(1)將精液與TALP稀釋液等量混合，離心洗滌3次，每次1 000～1 500 r/min，共5 min。(2)離心后的精液用Ⅰ液按1∶2等溫稀釋(34 ℃)，用12～15層紗布包裹貯精瓶，連同Ⅱ液一起放入2～5 ℃冰箱中平衡1.5～2 h。(3)平衡后的精液用Ⅱ液等倍稀釋，并裝入0.25 mL細(xì)管后再平衡0.5～1 h。(4)將液氮倒入完好的泡沫盒中，將細(xì)管架浸入液氮中預(yù)冷至液氮停止沸騰時(shí)提取細(xì)管架，固定于離液氮面2～3 mm的位置，將細(xì)管平放于細(xì)管架上熏蒸2～3 min后浸入液氮中保存。(5)42 ℃水浴解凍10 s后進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 精液質(zhì)量利用全自動(dòng)精液質(zhì)量分析系統(tǒng)對(duì)4只貴州黑山羊種羊精液進(jìn)行檢測(cè)，由表2可見：耳號(hào)為N7003的羊精子總體活力、向前移動(dòng)活力、快速前進(jìn)活力均最高，分別為91.41、59.69、47.60。其次是N7182號(hào)，分別為85.53、57.74、40.10。因此選擇這2只種羊的精液制作冷凍精液。

表2 貴州黑山羊原精液質(zhì)量檢測(cè)

2.2 不同稀釋液配方對(duì)冷凍精液質(zhì)量的影響由表3可見：(1)添加乙二醇保護(hù)劑的4組中，總體活力最高的是3-1組(67.06±10.10)，其次為1-1組(58.85±5.73)，2個(gè)組之間差異不顯著，均顯著高于2-1組與4-1組；前進(jìn)式活力最高的是1-1組(17.22±0.34)，除與3-1組之間差異不顯著外，均顯著高于2-1組、4-1組；4個(gè)組的精子畸形率均高于20%，最高的為3-1組(29.06±16.11)。(2)添加甘油保護(hù)劑的4組中，總體活力最高的是3-2組(56.95±7.83)，前進(jìn)式活力最高的是1-2組(22.73±6.25)，結(jié)果與添加乙二醇保護(hù)劑的一致；精子畸形率最高的是2-2組(27.37±6.59)，最低的是4-2組(15.35±4.69)，但4-2組精子活力最低。(3)除2-1組外，添加乙二醇保護(hù)劑的1-1、3-1、4-1組的精子總體活力均要高于相對(duì)應(yīng)的添加甘油的1-2、2-2、4-2組，而精子畸形率則相反；同時(shí)，添加甘油保護(hù)劑的1-2、2-2、3-2組精子前進(jìn)式活力均要高于相對(duì)應(yīng)的添加乙二醇的1-1、2-1、3-1組，最高為1-2組(22.73±6.25)。

表3 不同稀釋液配方的精子質(zhì)量檢測(cè) %

3 討論

3.1添加2種不同冷凍保護(hù)劑的4種稀釋液配方對(duì)貴州黑山羊冷凍精液的影響不一，總體上是使用乙二醇保護(hù)劑的精子總體活力和畸形率高于甘油保護(hù)劑，但精子的前進(jìn)式活力低于甘油保護(hù)劑。雖然人工授精通常為深部輸精，但仍然需要精子向前移動(dòng)的能力，所以甘油作為冷凍保護(hù)劑的效果要高于乙二醇。這也與他人對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊凍精的研究結(jié)果一致[6]。因此，在貴州黑山羊凍精生產(chǎn)過程中建議選擇配方1或配方3作為稀釋液配方，甘油作為冷凍保護(hù)劑。

3.24種配方的冷凍精液精子畸形率大部分都高于20%，不符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《山羊冷凍精液》(GB 20557—2006)的要求，有可能是在推片過程中操作不當(dāng)所致。

4 結(jié)論

綜合評(píng)價(jià)，在貴州黑山羊凍精生產(chǎn)過程中可選擇配方1或配方3作為冷凍精液稀釋液配方，甘油作為冷凍保護(hù)劑。