梁馨文，邢 璐，董世雄，徐士軍，張 健，段夢(mèng)琪，張 博，商 鵬*

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏林芝 860000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100094）

肌肉是評(píng)定豬肉肉質(zhì)性狀的重要標(biāo)志之一，也是豬維持正常運(yùn)動(dòng)和生理代謝過(guò)程中必不可少的組成部分[1]。動(dòng)物的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制非常復(fù)雜，是受許多遺傳基因以及信號(hào)通路等復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的[2]。組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白1（histidine triad nucleotidebinding protein1，HINT1）基因是HIT蛋白超家族的成員之一[3-4]，屬于組氨酸三聚體蛋白核苷酸轉(zhuǎn)移酶和水解酶家族成員[5]，在原核生物和真核生物中廣泛表達(dá)[6]。有研究報(bào)道，哺乳動(dòng)物HINT1蛋白可作用于多種信號(hào)通路[7]，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、在促使細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用[8]。截至目前，多數(shù)研究報(bào)道圍繞HINT1基因大多跟人類(lèi)疾病相關(guān)，已有研究證實(shí)HINT1基因的突變會(huì)導(dǎo)致人類(lèi)常染色體軸突神經(jīng)病變伴神經(jīng)肌強(qiáng)直[9]，這些患者會(huì)出現(xiàn)肌肉無(wú)力，肌肉萎縮等相關(guān)癥狀[10-11]，表明HINT1基因?qū)∪馍L(zhǎng)性狀和肌肉發(fā)育具有一定的影響。HINT1基因在豬肌肉生長(zhǎng)上的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

大約克豬是著名的瘦肉型豬種，具有生長(zhǎng)速度快、飼料利用率高和瘦肉率高等特點(diǎn)[12]。藏豬是世界上少有的高原型畜種，也是我國(guó)特有的地方品種資源，其能適應(yīng)惡劣的高寒氣候，具有體型小、生長(zhǎng)速度慢[13]和胴體瘦肉率低等特點(diǎn)[14]。藏豬是西藏開(kāi)發(fā)特色產(chǎn)業(yè)和推廣綠色食品的重要物種資源，圍繞藏豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀的研究顯得越發(fā)重要，本試驗(yàn)主要探究HINT1基因在藏豬和大約克豬中的多態(tài)性以及在兩豬種的背最長(zhǎng)肌和腿肌組織中的表達(dá)水平，為進(jìn)一步了解HINT1基因在豬肌肉組織中的調(diào)控作用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物材料

試驗(yàn)選擇飼養(yǎng)于西藏林芝市西藏農(nóng)牧學(xué)院教學(xué)實(shí)習(xí)牧場(chǎng)（海拔2 900 m左右）的藏豬（TP）和林芝市宇高生態(tài)農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司的大約克豬（YY）作為試驗(yàn)對(duì)象。試驗(yàn)豬只均為去勢(shì)公豬，隨機(jī)挑選30日齡、90日齡及180日齡且各個(gè)日齡的生長(zhǎng)情況相近的藏豬和大約克豬各8頭進(jìn)行屠宰，屠宰后30 min內(nèi)采集背最長(zhǎng)肌組織和腿肌組織，放入RNA保存液，待RNA保存液與樣本充分接觸后置于液氮中保存，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存，用于總RNA提取。采集93份耳組織（藏豬48頭，大約克豬45頭），置于75%酒精中，-20℃保存用于DNA提取。

1.2 主要試劑

RNase free water、Fastking cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Power Taq PCR Master Mix（Bioteke Gorporation）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green)、Trizol（Thermo fisher）、SYBR Green Mix等均來(lái)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 DNA、RNA的提取及cDNA制備

采用苯酚-氯仿法從耳組織中提取基因組DNA，提取合格的DNA放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Trizol法提取RNA，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的濃度，配置1%的瓊脂糖膠分別檢測(cè)RNA和DNA的完整性，提取合格的RNA放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用一步法cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

從NCBI官網(wǎng) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載HINT1基因的mRNA序列（登錄號(hào)：NM_005661623），用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)，以GAPDH（登錄號(hào)：NM_001206359）作為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行設(shè)計(jì)并合成，合成后用RNase-Free water溶解，于4℃保存，定量引物見(jiàn)表1。

表1 定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative analysis

1.5 DNA引物設(shè)計(jì)與合成

登錄 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank），下載 HINT1 基因(登錄號(hào)：NC_010444)DNA序列。使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)HINT1基因5'側(cè)翼區(qū)的特異性引物，送至上海生物工程有限公司合成，合成后用RNase-Free water溶解，4℃保存，引物序列見(jiàn)表2。

表2 HINT1基因5'側(cè)翼區(qū)引物序列Table 2 Primer sequence of HINT1 gene 5'lateral region

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以cDNA為模板，選用GAPDH為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，PCR反應(yīng)體系20 μL:SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，RNase-free ddH2O 8 μL，cDNA 模板 1 μL。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（羅氏，Light Cycler96）進(jìn)行擴(kuò)增。

1.7 HINT1基因的SNPs位點(diǎn)篩選

采用Sanger測(cè)序法對(duì)藏豬和大約克豬HINT1基因的起始密碼子上游3 000 bp區(qū)域左右進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析。以提取的藏豬和大約克豬DNA為模板，首先選取藏豬和大約克豬各10頭，采用混池測(cè)序?qū)INT1基因分析，經(jīng)Chromas Pro軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析，篩選出具有有效突變意義的SNPs位點(diǎn)后，擴(kuò)大樣本進(jìn)行單個(gè)個(gè)體測(cè)序，由上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將所得測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因型頻率與基因頻率統(tǒng)計(jì)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

首先使用Excel整理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果，采用2-ΔΔCt法計(jì)算HINT1基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS 25.0軟件對(duì)HINT1基因表達(dá)量進(jìn)行顯著性分析，利用Graphpad Prism8制備圖表，軟件以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。運(yùn)用Excel計(jì)算各個(gè)突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率，使用卡方檢驗(yàn)分析HINT1基因的基因型頻率和基因頻率的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取結(jié)果

所提取的組織RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量較好。由圖1可知，28s和18s條帶清晰，其OD值范圍在1.8～2.2之間，無(wú)降解也未有蛋白質(zhì)和DNA污染，無(wú)明顯拖尾，滿足了后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖1 RNA樣品凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Gel electrophoresis results of RNA samples

2.2 HINT1基因在肌肉組織中的mRNA表達(dá)

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HINT1基因在藏豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌和腿肌組織中的表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2A可知，HINT1基因在30日齡藏豬背最長(zhǎng)肌組織中的mRNA表達(dá)量極顯著高于大約克豬（P20.01）；90日齡藏豬和大約克豬表達(dá)差異不顯著（P30.05）；180日齡藏豬背最長(zhǎng)肌組織中的mRNA表達(dá)量顯著高于大約克豬（P20.05）。由圖2B可知，HINT1基因在30日齡和90日齡藏豬腿肌組織中的 mRNA表達(dá)量極顯著高于大約克豬（P20.01），180日齡藏豬腿肌組織中的mRNA表達(dá)量顯著高于大約克豬（P20.05）。

圖2 藏豬大約克豬HINT1基因30、90和180 d在背最長(zhǎng)肌、腿肌組織中mRNA表達(dá)量Figure 2 mRNA expression levels of HINT1 gene in longissimus dorsi muscle and leg muscle of Tibetan pigs at 30,90 and 180 days of age

2.3 HINT1基因的SNPs位點(diǎn)分析

利用Chromas Pro和SPSS18.0進(jìn)行分析，HINT1基因共有5個(gè)突變位點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖3分別為：A-2230G、C-2209T、A-2174G、T-2083C 和 A-2082G，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，所存在的5個(gè)突變位點(diǎn)均符合哈迪-溫伯格定律（P30.05）?；蛐皖l率、基因頻率及卡方檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 HINT1基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率Table 3 HINT1 gene polymorphism loci genotype frequency and allele frequency

圖3 HINT1基因SNPs位點(diǎn)測(cè)序峰圖Figure 3 Sequencing peak of SNPs of HINT1 gene

3 討論

肌肉發(fā)育是由營(yíng)養(yǎng)、時(shí)間、飼養(yǎng)管理、基因等多種因素共同影響的[15]，其中基因作為影響其發(fā)育的內(nèi)在因素受到育種工作者的高度關(guān)注。組氨酸三聚體蛋白超家族是一個(gè)具有核苷酸轉(zhuǎn)移酶和水解酶活性的家族，HINT1蛋白是組氨酸三聯(lián)體（HIT）家族的成員之一[16]，它是一類(lèi)普遍存在于哺乳動(dòng)物組織、在進(jìn)化中高度保守、分布最為廣泛的一種蛋白[17]。有研究證實(shí)，HINT1基因的缺失會(huì)促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)[18]，肌肉組織是從中胚層細(xì)胞中分化而形成的，中胚層分化出兩種不同類(lèi)型的細(xì)胞，即成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)一步影響肌肉組織發(fā)育。在陳瑩等[1]的研究中表明了在不同階段藏豬與大約克豬中背最長(zhǎng)肌組織的表達(dá)有著顯著差異，且根據(jù)豬的生長(zhǎng)趨勢(shì)以及前人的研究報(bào)道得知豬的快速生長(zhǎng)階段是2～6月齡[19]，所以本文分別選取了30日齡、90日齡、180日齡的藏豬和大約克豬作為試驗(yàn)對(duì)象。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，藏豬HINT1基因在背最長(zhǎng)肌和腿肌組織中的表達(dá)量均在30日齡時(shí)達(dá)到巔峰，隨后在90日齡和180日齡呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，并且在30日齡時(shí)藏豬的背最長(zhǎng)肌和腿肌組織中的表達(dá)水平極顯著高于大約克豬（P20.01）。在90日齡時(shí)藏豬的背最長(zhǎng)肌組織中的表達(dá)量高于大約克豬，但差異不顯著（P=0.284），但在腿肌組織中藏豬的表達(dá)水平極顯著高于大約克豬（P20.01），這說(shuō)明不同豬種的肌肉組織在不同生長(zhǎng)時(shí)期的生長(zhǎng)速度是不同的，而藏豬在剛出生時(shí)的肌肉生長(zhǎng)速度明顯低于大約克豬[20-21]，這可能是藏豬生長(zhǎng)緩慢的原因之一，且90日齡和180日齡是豬肌肉發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，藏豬和大約克豬分別在兩組織上表達(dá)趨勢(shì)一致，但在90日齡稍有差別，這可能與不同發(fā)育階段不同肌纖維類(lèi)型生長(zhǎng)速度不一致有關(guān)[22]。180日齡時(shí)藏豬的背最長(zhǎng)肌和腿肌組織中的表達(dá)水平顯著高于大約克豬（P20.05）。結(jié)合李潔等[23]的研究表明HINT1基因與氨酰-tRNA合成酶具有相同的水解產(chǎn)物，而表達(dá)氨酰-tRNA合成酶的相關(guān)基因會(huì)導(dǎo)致腓骨肌萎縮[23]。推測(cè)HINT1基因在豬的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

本研究在HINT1基因5'側(cè)翼區(qū)起始密碼子上游3 000 bp左右發(fā)現(xiàn)5個(gè)突變位點(diǎn)：A-2230G、C-2209T、A-2174G、T-2083C 和 A-2082G。上述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率在藏豬和大約克豬中存在極顯著差異（P20.01），且符合哈迪溫伯格定律，推測(cè)這5個(gè)SNPs位點(diǎn)多態(tài)性可能是受HINT1基因調(diào)控后的品種間性狀導(dǎo)致。結(jié)合5個(gè)SNPs位點(diǎn)的多態(tài)性與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，進(jìn)一步證明了HINT1可能是影響豬肌肉生長(zhǎng)的關(guān)鍵功能位點(diǎn)，這符合藏豬和大約克豬的品種特性。研究結(jié)果表明HINT1基因會(huì)抑制肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育，但是對(duì)于該基因具體分子調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步討論。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究采用RT-qPCR和Sanger測(cè)序法，從不同品種豬的兩個(gè)肌肉組織著手，探究了HINT1基因5'側(cè)翼區(qū)域的多態(tài)性及mRNA表達(dá)差異的分析，推測(cè)5'側(cè)翼區(qū)SNPs的變化影響了HINT1基因的mRNA表達(dá)水平，且HINT1基因的表達(dá)與骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索豬生長(zhǎng)發(fā)育及分子輔助育種提供一定的新思路和理論依據(jù)。