侯立鵬，馬麗芳，王瑞青

(1.西安市第九醫(yī)院 口腔科，陜西 西安 710054； 2.軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，陜西省口腔醫(yī)學重點實驗室，第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院 牙體牙髓病科，陜西 西安 710032； 3.第四軍醫(yī)大學 基礎醫(yī)學院，陜西 西安 710032)

骨缺損是骨外科臨床上常見的難題，骨再生修復材料始終是骨科研究的熱點之一[1]；“支架”“種子細胞”“細胞因子”是骨組織修復材料不可或缺的三要素[2]。種子細胞方面，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)是研究最多也是最成熟的細胞之一[3]，但其體內(nèi)、外的成骨能力較低。因此，提高BMMSCs的成骨效率成為國內(nèi)外研究的熱點[4- 5]。

種子細胞的定向分化離不開微環(huán)境中的誘導因素，很多證據(jù)表明炎癥在骨折早期修復中起著重要的作用[6- 7]。一種新的方法是直接調(diào)節(jié)炎癥因子的活性來促進骨質(zhì)的再生，炎癥因子中研究最多的是腫瘤壞死因子α(TNF- α)[8]。有實驗證實，大鼠骨折的24 h內(nèi)存在表達多種炎癥因子如TNF- α、白細胞介素(IL)- 6、和IL- 1β的一個短暫的爆發(fā)期，一直持續(xù)3 d后才開始衰退[9]。據(jù)報道，短時間暴露于TNF- α可增強肌源性基質(zhì)細胞的堿性磷酸酶(ALP)的活性和礦化結節(jié)的形成[10]，增加牙根尖乳頭細胞的礦化[11]，并促進脂肪干細胞的骨再生[12- 13]。

本實驗擬選用不同濃度的TNF- α短期刺激BMMSCs來檢測其體內(nèi)體外促進成骨分化的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

MTS細胞增殖檢測試劑盒(Solarbio公司)，ALP活性檢測試劑盒(Beyotime公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)，蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(康為世紀生物科技有限公司)，TNF- α(R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMMSCs的原代培養(yǎng) 人BMMSCs的培養(yǎng)參考文獻[14]中的方法。將分離所得的單個核細胞以1.6×105個·cm-2的密度接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，加入DMEM- LG培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；接種48 h后換液，去除非貼壁細胞，以后每3～4 d換液1次，待細胞擴增鋪滿整個培養(yǎng)瓶表面的80%時用0.25%胰酶- 0.02%EDTA液消化分離貼壁細胞，進行傳代接種培養(yǎng)，并記為第1代(P1代)，繼而傳代至所需的代數(shù)P5進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞增殖試驗 將培養(yǎng)的P5代細胞懸液以1×104個·孔-1種植于96孔板中，每孔100 μl，分為不加TNF- α的對照組和TNF- α 1、10、50 ng·ml-1組共4組，每組5個復孔，預培養(yǎng)24 h后棄去孔內(nèi)液體，分別加入0、1、10、50 ng·ml-1濃度的TNF- α誘導液刺激的BMMSCs。3 d后PBS漂洗3遍，常規(guī)細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 d，分別在1、4、7 d取出固定，7 d后統(tǒng)一加入20 μl MTS溶液并放置培養(yǎng)箱中孵育2～4 h，吸去孔內(nèi)液體呈藍色結晶，再加入100 μl DMSO，置于水平搖床10 min 充分溶解藍色結晶，酶標儀490 nm波長處測吸光度(OD490 nm)值。參照MTS試劑盒說明書進行檢測。

1.2.3 細胞遷移試驗 將P5代細胞密度調(diào)整為3×104個·ml-1,吹打均勻后向小室內(nèi)加入細胞懸液200 μl，小室下層分別加入0、1、10、50 ng·ml-1TNF- α溶液、500 μl不含10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液，細胞小室37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后取出，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗小室2遍，4%多聚甲醛溶液固定細胞20 min，結晶紫染液染色10 min，PBS沖洗2遍。用棉簽將小室上層未穿過小室膜的細胞拭去，干燥后倒置于熒光顯微鏡下(放大倍數(shù)為200倍)觀察細胞數(shù)目。

1.2.4 ALP活性檢測 將P5代細胞以2×104個·孔-1種植于48孔板中，0、1、10、50 ng·ml-1TNF- α溶液分別刺激3 d后，加入成骨培養(yǎng)液(含100 ng·ml-1地塞米松、50 μg·ml-1維生素C 和10 mmol·L-1β甘油磷酸鈉)繼續(xù)培養(yǎng)2周，去除培養(yǎng)基，冰PBS洗3遍，裂解液裂解細胞，冰上放置30 min，之后4 ℃、1 200 r·min-1離心30 min，取上清采用ALP活性試劑盒按說明書步驟進行檢測。

1.2.5 TNF- α水凝膠的制備 明膠- TNF- α復合水凝膠的制備過程參考文獻[15- 17]的方法。取100 mg明膠粉末融入900 μl PBS中，70 ℃攪拌1 h，然后將溶液裝入注射器中備用。

1.2.6 小鼠極限模型、微計算機斷層掃描技術(micro- CT)三維模型的構建及HE染色 小鼠分成含有生理鹽水水凝膠的對照組和分別含有1、50 ng TNF- α溶液的水凝膠實驗組3組。將麻醉的大鼠頭皮上打開約20 mm的切口，充分暴露頭蓋骨，掀開骨膜后用電鉆沿著矢狀縫合線鉆開一塊5 mm的骨頭，明膠海綿及時止血。再將分別含有生理鹽水及1、50 ng·ml-1TNF- α的水凝膠置于傷口處，8周后將大鼠處死，取下顱骨標本，至少保留缺損周圍2 mm正常顱骨，沿矢狀縫分離雙側標本，分別對每個標本進行micro- CT掃描、三維重建。micro- CT掃描結束后，所有標本用10%中性緩沖福爾馬林溶液固定72 h，EDTA溶液脫鈣，期間用大頭針輕戳標本，至針頭可輕松刺入標本中提示脫鈣完成，脫鈣時間4～6周，脫鈣完成后60%乙醇4 h→70%乙醇4 h→80%乙醇4 h→正丁醇8 h脫水，完成后常規(guī)石蠟包埋，再以5 μm厚度連續(xù)切片，所得切片行HE染色，觀察各組成骨情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 BMMSCs細胞增殖測定結果

在不同濃度的TNF- α溶液中接種BMMSCs，1、4、7 d 后進行OD值測量，從第1～第7天，實驗組和對照組細胞含量均有所增加，且組間無明顯差異，不同濃度的TNF- α對BMMSCs的增殖無影響，見圖1。

圖1 各組不同時間的OD490 nm值

2.2 BMMSCs細胞遷移實驗結果

與對照組相比，各實驗組細胞遷移能力增強，且TNF- α濃度越高，細胞遷移能力越強，50 ng·ml-1TNF- α組的趨化效果最好，見圖2。

圖2 不同濃度的TNF- α能促進BMMSCs的遷移 A、B、C、D依次為1、10、50 ng·ml-1 TNF- α組及對照組

2.3 ALP的活性檢測

BMMSCs在不同組1周和2周的ALP活性變化情況如圖3，顯示各組在1周時ALP活性均較低，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在2周時1、10、50 ng·ml-1TNF- α均能顯著促進BMMSCs的遷移(P<0.05)，且呈濃度依賴性遞增，加入50 ng·ml-1TNF- α的成骨效果最好。

1、2、3、4依次為對照組及1、10、50 ng·ml-1 TNF- α組

2.4 micro- CT及HE染色

見圖4、5。術后各組邊緣至中央均有不同程度的新生骨長入，對照組則成骨速度較慢。HE染色結果顯示各實驗組和對照組缺損處均有新骨沉積，實驗組的新骨形成顯著多于對照組。實驗組新骨沉積呈連續(xù)的整體形態(tài)，大部分骨缺損由致密的新骨填充，可見大量新形成的成熟骨組織，且50 g·ml-1TNF- α組的成骨效果最好。相比之下，對照組在缺損邊緣顯示出非常有限的新骨，呈不連續(xù)的島狀，缺損處的中心位置以纖維結締組織為主。

○中為1 ng·ml-1 TNF- α組； □中為50 ng·ml-1 TNF- α組； ▽中為對照組

3 討 論

本實驗通過不同濃度的TNF- α作用于BMMSCs，檢測TNF- α對BMMSCs生物活性的影響。

細胞增殖活性是活細胞的重要生理功能之一。MTS比色法是常用的檢測細胞數(shù)量變化的方法，測定吸光度可間接反映活細胞數(shù)量，從而反映出活細胞的代謝水平。本實驗加入不同濃度TNF- α溶液的BMMSCs增殖活性無明顯差異。小室遷移實驗反映細胞遷移的快慢及趨化能力的強弱。骨缺損的再生有賴于成骨細胞的遷移。顯微鏡下觀察實驗組細胞數(shù)明顯較對照組增多，且加入1 ng·ml-1與10 ng·ml-1TNF- α溶液的細胞遷移數(shù)量相差不明顯，而加入50 ng·ml-1TNF- α溶液的細胞數(shù)目明顯增多，說明隨TNF- α溶液濃度的增加遷移加快。ALP是反映成骨活性的重要指標，ALP活性能比較客觀地反映成骨細胞分化成熟的程度[18]。本研究結果顯示，各組在7 d時ALP活性均較低，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在成骨誘導14 d 時，實驗組ALP活性較對照組顯著提高(P<0.05)，說明成骨分化一直在持續(xù)進行，該結果也提示TNF- α能夠促進成骨分化，且含有50 ng·ml-1TNF- α的活性最高。

干細胞向成骨分化過程中炎癥因子TNF- α起著重要的作用，其抑制或促進干細胞向成骨分化[19- 21]。

圖5 HE染色觀察骨形成情況 A.1 ng·ml-1 TNF- α組； B.50 ng·ml-1 TNF- α組； C.對照組

大量實驗證明，TNF- α對干細胞的作用時間是決定其促進或抑制成骨的主要因素之一，同時TNF- α抑制或促進干細胞向成骨分化的過程與多條信號通路有關。長時間(4周)的TNF- α刺激可呈劑量依賴性抑制成骨，抑制核因子(NF)- κB信號可逆轉這種效果，提示長期TNF- α刺激可能是通過NF- κB信號通路抑制成骨；而短時間(48 h)的TNF- α刺激可以通過MAPK信號通路下的JNK信號通路促進成骨[22]。這些均說明TNF- α短期作用可促進成骨分化而長期作用可抑制成骨分化，我們的實驗結果與之一致。

水凝膠是一種含有大量水分的三維大分子網(wǎng)絡，與天然細胞外基質(zhì)(ECM)有著驚人的相似性[23]。凝膠化過程，從液態(tài)到固態(tài)的轉變，可以通過一種微創(chuàng)注射的方式來實現(xiàn)。這種特性使得可注射水凝膠可用于組織工程，它們可以填充靶組織缺損并與之無縫結合[23- 30]。這種具有層次結構的水凝膠實現(xiàn)藥物的緩釋和控釋在體外支持細胞增殖和成骨，在體內(nèi)促進新生血管和骨缺損再生[31]。

體內(nèi)與體外環(huán)境具有較大差異，本研究進一步將不同濃度(1、50 ng·ml-1)的TNF- α溶液包裹于水凝膠中置于大鼠顱骨缺損處觀察其修復能力。三維micro- CT重建可對各組骨缺損愈合過程進行完整描述。實驗組和對照組都是從缺損區(qū)域的外周向內(nèi)進行骨生成；實驗組成骨速度顯著高于對照組，骨修復效果顯著。為了驗證micro- CT的分析結果，采用HE染色進行組織學觀察，發(fā)現(xiàn)對照組和實驗組缺損區(qū)域均有新骨沉積，實驗組的新生骨量顯著高于對照組，實驗組新生骨更加均勻、成熟，成骨厚度較高，與micro- CT觀察結果一致。

我們的實驗證明TNF- α短時間刺激BMMSCs具有促進BMMSCs遷移、增殖及誘導其成骨分化作用。

TNF- α對干細胞向成骨分化起著雙重作用，研究其具體機制對許多疾病的治療有著重要意義。本實驗通過TNF- α 3 d的短時間刺激促進了BMMSCs的成骨，這對深入研究炎癥因子與膜內(nèi)成骨之間的關系有重要參考價值，可為提高臨床基于BMMSCs的骨缺損治療效果提供理論基礎及優(yōu)化方案。