楊麗，劉永橋，劉彬

(應(yīng)城市人民醫(yī)院 1.病理科，2.肝膽外科，湖北 應(yīng)城 432400)

肝細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是全球第6大最常見(jiàn)的癌癥、第4大因癌致死的原因，嚴(yán)重威脅人的生命健康[1]。肝癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，闡明其機(jī)制并尋找潛在的分子生物學(xué)標(biāo)志物將有助于改善患者的生存預(yù)后。小腦鋅指蛋白(zinc finger protein of the cerebellum，ZIC)家族包括ZIC1、ZIC2、ZIC3、ZIC4、ZIC5 5個(gè)成員，各自編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子，組成5個(gè)Cys2His鋅指結(jié)構(gòu)域。ZIC家族在神經(jīng)、骨骼系統(tǒng)的發(fā)育中起到重要作用[2]。越來(lái)越多研究顯示，ZIC在多種疾病包括腫瘤[2- 3]發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其中ZIC5與腫瘤的關(guān)系最為密切。有研究顯示，ZIC5在前列腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌和膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并且參與其發(fā)生和發(fā)展[4- 6]。既往鮮有報(bào)道ZIC5在肝癌中的表達(dá)及其意義。本研究采用蛋白免疫印跡和免疫組化法檢測(cè)肝癌組織中ZIC5的表達(dá)，分析其與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

選取我院2010年1月至2013年1月手術(shù)切除的94例肝癌組織及其配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 術(shù)前未接受過(guò)放化療；(2) 術(shù)后組織病理學(xué)檢查確診為肝癌；(3) 病歷資料完整?；颊吲懦龢?biāo)準(zhǔn)：(1) 隨訪資料不全；(2) 合并其他腫瘤。術(shù)后門診及電話方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪截至2019年1月。手術(shù)切除的組織一部分用福爾馬林固定并石蠟包埋；另一部分凍存于-70 ℃冰箱。本研究經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)組織中ZIC5表達(dá)

隨機(jī)選取6例肝癌組織及其配對(duì)的癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)，取組織100 mg，充分研碎后加入組織裂解液(廣州捷倍斯生物科技有限公司)裂解20 min，隨后離心15 min，收集上清液。用BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)蛋白濃度。經(jīng)10%SDS- PAGE凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗(ZIC5單克隆抗體，1∶500)(美國(guó)Sigma公司)，4 ℃過(guò)夜后棄去一抗，TBST洗膜3次。隨后室溫孵育二抗，2 h后棄去二抗(艾美捷科技有限公司)，TBST洗膜3次。以GAPDH作為內(nèi)參，用ECL發(fā)光儀對(duì)蛋白進(jìn)行成像，用Image J軟件分析灰度值。

1.3 免疫組化染色法檢測(cè)組織中ZIC5的表達(dá)水平

檢測(cè)所有癌組織和癌旁組織中ZIC5的表達(dá)。石蠟切片均由我院病理科制備，厚度為4 μm。檢測(cè)時(shí)常規(guī)脫蠟至水。將切片放置于檸檬酸鹽緩沖液(上海微蒙生物技術(shù)有限公司)中微波煮沸5 min，冷卻至室溫。滴加3%過(guò)氧化氫(上海微蒙生物技術(shù)有限公司)除去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育10 min。隨后用山羊血清封閉10 min，滴加ZIC5單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)，4 ℃孵育過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗(美國(guó)Sigma公司)。最后用DAB顯色、蘇木紫復(fù)染。經(jīng)脫水、透明、封片處理后在顯微鏡下觀察。

根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞比例判斷ZIC5表達(dá)情況：(1) 陰性染色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；(2) 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0～10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～80%計(jì)3分，81%～100%計(jì)4分。將兩者計(jì)分相乘：0～3分為蛋白低表達(dá)(低表達(dá)組)；4～12分為蛋白高表達(dá)(高表達(dá)組)[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較用卡方檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan- Meier法；多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白免疫印跡法檢測(cè)組織中ZIC5表達(dá)水平

肝癌組織ZIC5相對(duì)表達(dá)量為0.86±0.13，明顯高于癌旁組織的0.25±0.08(t=9.789，P<0.001)，見(jiàn)圖1。

a 與肝癌組織相比，P<0.05

2.2 免疫組化染色法檢測(cè)組織中ZIC5的表達(dá)水平

ZIC5在癌旁組織中幾乎不表達(dá)，而在肝癌組織中高表達(dá)。ZIC5主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞核中也有少量表達(dá)(圖2)。肝癌組織中ZIC5高表達(dá)59例(62.77%)，低表達(dá)35例(37.23%)。

圖2 免疫組化染色法檢測(cè)組織中ZIC5的表達(dá)水平 A.ZIC5在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況(×100)； B.ZIC5在癌旁組織中幾乎不表達(dá)(×200)； C.ZIC5在肝癌組織中低表達(dá)(×200)； D.ZIC5在肝癌組織中高表達(dá)(×200)。NL為癌旁正常組織，HCC為肝癌組織

2.3 ZIC5與臨床病理特征的關(guān)系

ZIC5表達(dá)水平與肝癌分化程度、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及肝硬化有關(guān)(均P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小、甲胎蛋白水平及HBsAg狀態(tài)無(wú)關(guān)(均P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 ZIC5表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例

2.4 ZIC5表達(dá)與肝癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

Log- Rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，高表達(dá)組總生存率和無(wú)瘤生存率均低于低表達(dá)組(均P<0.001)，見(jiàn)圖3。

圖3 ZIC5表達(dá)與肝癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

2.5 肝癌患者生存預(yù)后的影響因素分析

COX多因素模型分析結(jié)果顯示，分化程度、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和ZIC5高表達(dá)是肝癌患者總生存期和無(wú)瘤生存期的獨(dú)立影響因素(均P<0.05)，見(jiàn)表2和表3。

表2 肝癌患者總生存期的單因素和COX多因素分析

表3 肝癌患者無(wú)瘤生存期的單因素和COX多因素分析

3 討 論

肝癌是臨床上常見(jiàn)的腫瘤，雖然近年來(lái)肝癌的診治技術(shù)有了飛速發(fā)展，但是患者的5年生存率仍未見(jiàn)明顯提高，尤其是晚期肝癌患者[8]。尋找肝癌新型分子生物學(xué)標(biāo)志并開(kāi)發(fā)潛在的治療靶點(diǎn)有重要意義。為此，我們檢測(cè)了ZIC5在肝癌組織中的表達(dá)變化，并評(píng)估了其在臨床病理和預(yù)后預(yù)測(cè)中的作用。

ZIC5的分子質(zhì)量大約68.4 kD，主要在神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)中發(fā)揮作用[2]。但是近年來(lái)大量研究顯示，ZIC5與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[2]。有研究[4- 6]發(fā)現(xiàn)，ZIC5在前列腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌和膠質(zhì)瘤中高表達(dá)。但既往也有相反的研究結(jié)果，如Ma等[2]檢測(cè)了ZIC家族的5個(gè)成員，發(fā)現(xiàn)胃癌僅與ZIC1相關(guān)，而與ZIC5無(wú)關(guān)。Han等[9]發(fā)現(xiàn)，在浸潤(rùn)性乳腺癌組織與正常組織中只有ZIC1表達(dá)具有差異，而ZIC5表達(dá)卻沒(méi)有差異，說(shuō)明ZIC5的表達(dá)可能與組織特異性有關(guān)。本研究蛋白免疫印跡和免疫組化染色結(jié)果顯示，肝癌組織中ZIC5表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，與Liu等[10]報(bào)道一致，提示ZIC5可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)。此外本研究也發(fā)現(xiàn)，ZIC5高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移、分化程度以及肝硬化有關(guān)。從分子機(jī)制分析：(1) ZIC5通過(guò)PDGFD基因介導(dǎo)FAK和STAT3的激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[11]；(2) ZIC5通過(guò)Wnt- β- catentin信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷徙，進(jìn)而影響患者的預(yù)后[10]；(3) ZIC5作為非編碼RNA的下游靶基因發(fā)揮作用[5,12]。

此外我們的研究結(jié)果還顯示，組織ZIC5高表達(dá)是影響肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高表達(dá)組總生存率和無(wú)瘤生存率均低于低表達(dá)組。ZIC5在既往研究中就被證明與多種類型腫瘤如結(jié)腸癌[13]、肺癌[6]等患者的生存預(yù)后有關(guān)。本研究用COX多因素分析和生存曲線證實(shí)了ZIC5與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系，ZIC5表達(dá)水平越高，肝癌患者總生存時(shí)間和無(wú)瘤生存時(shí)間越短，表明ZIC5可能具有成為肝癌預(yù)后標(biāo)志物的潛力。

本研究存在一些局限性：(1) 未分析ZIC5與肝癌患者放化療敏感性的關(guān)系；(2) 樣本量相對(duì)較少；(3) 未檢測(cè)肝癌患者外周血ZIC5的表達(dá)，ZIC5對(duì)肝癌早期診斷的價(jià)值仍需未來(lái)進(jìn)一步探討；(4) 未開(kāi)展細(xì)胞或動(dòng)物學(xué)研究探索ZIC5在肝癌中的具體作用機(jī)制。

綜上所述，肝癌組織中ZIC5表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，ZIC5與肝癌分化程度、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和肝硬化有關(guān)，ZIC5高表達(dá)可能預(yù)示患者總生存期和無(wú)瘤生存期較短。未來(lái)需要進(jìn)一步探討ZIC5在肝癌中的作用機(jī)制。