唐德富，陳志剛，李 飛，郭 濤，潘發(fā)明，郝生燕，徐琳娜, 4

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 / 蘭州大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 / 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020 ；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；4.甘肅省畜牧技術推廣總站，甘肅 蘭州 730030）

玉米(Zea mays)是動物飼料中主要的能量來源，按其收獲物和用途可劃分為籽粒玉米、鮮食玉米和青貯玉米3 類[1]。青貯玉米作為反芻動物重要的粗飼料來源，是支撐我國畜牧業(yè)發(fā)展的“標桿性”飼料，其營養(yǎng)價值高、適口性好，也是制作青貯飼料的優(yōu)質(zhì)原材料[2-3]。與普通玉米相比，雖然青貯玉米可利用能量僅為普通籽實玉米的一半，但產(chǎn)量卻較是普通玉米的4～5 倍[4]。影響青貯玉米飼用品質(zhì)的原因較多，品種和收獲期是非常重要的兩個因素[5]。不同品種的青貯玉米在生長過程中營養(yǎng)成分變異較大[6]，而且相同品種不同部位(組織)由于組織結構和化學組成不同，營養(yǎng)價值也不盡相同，其中莖稈中纖維和木質(zhì)素含量較高；葉片和苞葉組織柔軟，適口性好且含有豐富的糖和粗蛋白；籽粒的營養(yǎng)價值最高，是優(yōu)質(zhì)能量飼料[7]。薛紅楓等[8]研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈各部位間碳水化合物含量存在極顯著差異，其中莖皮部分主要含有可溶性糖和有機酸，而苞葉部分含有大量淀粉和果膠。玉米秸稈不同部位瘤胃干物質(zhì)消失率也存在明顯差異，葉片最高，苞葉次之，莖稈最低[9]，因此，將青貯玉米不同部位(組織)按比例混合青貯，有利于提高青貯飼料品質(zhì)和秸稈的整體利用率。然而青貯飼料制作前如何快速評定青貯玉米營養(yǎng)價值是一個亟待解決的生產(chǎn)難題。

傳統(tǒng)的濕化學分析方法花費大量的人力、物力、財力，并且所用試劑會污染環(huán)境[10]。近紅外光譜分析技術(near infrared spectrum instrument, NIRS)是將光譜測量技術與化學計量學方法有機結合，測定有機物中高能鍵(C-H、N-H、O-H 等)在中紅外光譜區(qū)基頻吸收的倍頻、合頻和差頻疊加而成的吸收帶，再采用主成分分析(principal component analysis,PCA)、改良偏最小二乘法(modified partial least squares,MPLS)和 人 工 神 經(jīng) 網(wǎng) 絡(artificial neural networks,ANN)等化學計量學方法建立待測物質(zhì)營養(yǎng)成分含量和物質(zhì)光譜之間的線性或非線性模型[11]。NIRS具有測試重現(xiàn)性好、分析速度快(3～4 min)、效率高、適用范圍廣、成本低等特點[12-13]，已被廣泛應用于飼料行業(yè)。向娜娜等[14]利用NIRS 構建了大豆皮粗纖維、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)含量的檢測模型，模型決定系數(shù)(R2)大于0.9，檢測精確度和準確度均較好，能夠應用于生產(chǎn)實際。何云等[15]利用NIRS 建立了苜蓿(Medicago sativa)干草常規(guī)養(yǎng)分的近紅外預測模型，其中干物質(zhì)、粗蛋白、NDF 和ADF 含量的近紅外預測模型較好，能夠用于生產(chǎn)，類似的結果郭濤等[16-17]均有報道。本研究通過測定青貯玉米原料中不同部位(組織)樣品中干物質(zhì)、有機物、粗蛋白、粗脂肪、NDF、ADF 和酸性洗滌木質(zhì)素(acid detergent lignin, ADL)的含量，結合NIRS 建立青貯玉米各部位(組織)營養(yǎng)成分的預測模型，為快速準確評定青貯玉米原料營養(yǎng)價值和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)青貯飼料提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與制備

試驗青貯玉米樣品于2018年5月 – 8月在甘肅省民勤縣采集，采集的青貯玉米樣品共包括23 個品種，主要有金嶺1804、金嶺1820、金嶺1824、金嶺1825、金嶺17、金嶺10、金嶺27、金嶺67、金嶺1818、金嶺37、金嶺1815、金嶺1819、金嶺1821、金嶺1823、寧和1506、鐵研53、中單29、東單60、屯玉168、金剛50、寧青108、正大12 和渝青玉3 號。試驗樣品于玉米生長期第92、97、102、107、112、125、130 和135 天共8 個收獲期采集，采樣時按照莖、葉、果穗、整株分開采樣，其中整株青貯玉米樣品77份，莖、葉、果穗各50 份，共計227 份。采集的莖、葉樣品切短至3～5 cm，果穗包含苞葉和玉米芯，切碎后直接裝袋帶回實驗室65 ℃烘干48 h，取出置室內(nèi)常溫回潮24 h，粉碎過1 mm 篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 養(yǎng)分含量測定

青貯玉米樣品中干物質(zhì)、有機物、粗蛋白、粗脂肪、NDF、ADF 和ADL 含量的測定參考張麗英[18]所述方法。ADL 含量測定參考李澤民等[19]，具體方法如下：將測完ADF 的濾袋用72%濃硫酸室溫下浸泡3 h，期間每30 min 攪拌一次，浸泡完成后用熱蒸餾水反復沖洗，直至pH 達到中性值，然后放入烘箱105 ℃烘干，冷卻，稱重，然后將裝有殘渣的濾袋裝入已知質(zhì)量的坩堝中，先在電爐炭化至無煙，于馬弗爐550 ℃灼燒4 h，取出后于干燥器冷卻至室溫，準確稱量坩堝加灰分質(zhì)量。計算公式：ADL(%) =[(m2–m1) – (m4–m3)]/m× 100%。式中：m1為空濾袋質(zhì)量，m2為稱取的樣品質(zhì)量，m3為坩堝質(zhì)量，m4為坩堝加灰分質(zhì)量。

1.3 青貯玉米的近紅外分析

1.3.1 近紅外光譜采集

試驗樣品掃描前，近紅外光譜儀(FOSS DS2500F，丹麥)需開機預熱15～20 min，待自檢通過后，將待測樣品混合均勻裝入樣品杯中，每次裝樣量不超過樣品杯總容積的2/3，然后置于檢測器中進行掃描。每份樣品重復裝樣掃描3 次，掃描波長為850～2 500 nm, 光譜分辨率0.5 nm，最終得到227 份青貯玉米樣品的近紅外原始光譜圖譜(圖1a)。因為同一種物質(zhì)含有不同的含氫基團，因此在整個近紅外光譜圖上存在多個吸收峰，為營養(yǎng)成分含量的定量分析奠定了基礎。青貯玉米一階導數(shù)處理主要是為了消除基線和背景干擾，提高光譜信噪比，消除光譜散射、背景干擾和基線漂移，盡可能提取圖譜中的有效信息[20]。青貯玉米原始光譜圖(圖1a)經(jīng)過一階導數(shù)處理(圖1b)和二階導數(shù)處理(圖1c)特征峰明顯增多，說明建模條件較好。

圖1 青貯玉米樣品原始近紅外光譜圖(a)、一階導數(shù)處理圖(b)和二階導數(shù)處理圖(c)Figure 1 Near infrared original spectra (a), first derivative spectra (b), and second derivative spectra(c) of silage corn samples

1.3.2 青貯玉米定標集和驗證集的劃分

227 個青貯玉米樣品采用濃度梯度法[15]，按照樣本集每個指標化學分析值的大小進行排序，然后將所有樣品按照4 ? 1 的比例，選出182 個樣品作為定標集用于模型構建，45 個樣品作為驗證集用于模型檢驗。

1.3.3 近紅外預測模型的建立和驗證

利用近紅外光譜儀自帶WinISI Ⅳ軟件建立定標模型，在使用MPLS 模塊建立定標模型的過程中，為了消除噪音、溫度等無關因素對樣品掃描的干擾，原始光譜采用3 種導數(shù)處理和10 種光譜散射校正處理相結合的方法進行預處理，其中3 種導數(shù)處理包括(0，0，1，1)、(1，4，4，1)、(2，4，4，1)，數(shù)值依次分別代表處理階數(shù)、數(shù)據(jù)間隔、一次平滑點數(shù)和二次平滑點數(shù)[21]；10 種散射校正包括無處理、標準正?；幚?、標準多元離散校正處理、加權多元離散校正處理、標準正常化和散射處理、反向多元離散校正處理、去散射處理、偏移處理、線性處理和二次處理。具體建模過程及方法參照郭濤[16]所述執(zhí)行。

定標模型建立后，通常采用定標決定系數(shù)(coefficient of determination for calibration, RSQc)、定標標準分析誤差(standard error of calibration, SEC)、交叉驗證決定系數(shù)(1 minus the variance ratio, 1-VR)和交叉驗證標準誤差(standard error of cross-validation,SECV)等指標來綜合判斷模型優(yōu)劣，其中1-VR 和RSQC越大、SEC 和SECV 越小，說明該定標模型越好，以最高的1-VR 和最低的SECV 確定為最優(yōu)定標模型[22]。

為進一步確定模型預測結果的準確性，優(yōu)化獲得的最優(yōu)定標模型還需采用驗證集樣品進行外部驗證，主要參考驗證決定系數(shù)RSQv 和預測相對分析誤差(ratio of performance to deviation for validation, RPDV)進行判定，當RSQV值越接近1，模型預測結果越準確，而生產(chǎn)實際中當RSQV> 0.8 或當RPDV≥ 2.5 時，定標模型即可用于實際檢測[23-24]。

2 結果與分析

2.1 青貯玉米養(yǎng)分含量的測定

除了干物質(zhì)外，試驗用青貯玉米樣品其他營養(yǎng)物質(zhì)(有機物、粗脂肪、粗蛋白、NDF、ADF 和ADL)含量的分布范圍較廣，數(shù)據(jù)變異較大，驗證集養(yǎng)分含量范圍包含在定標集內(nèi)，樣品分集符合建模要求(表1)。

表1 青貯玉米樣品定標集和驗證集養(yǎng)分含量(干物質(zhì)基礎)Table 1 Nutrient contents of the silage corn samples in the calibration and validation sets (DM basis)

2.2 青貯玉米近紅外模型的建立和優(yōu)化

通過全局距離剔除干物質(zhì)、有機物、粗脂肪、粗蛋白、NDF、ADF 和ADL 等養(yǎng)分變異度較大數(shù)值個數(shù)分別為1、2、2、1、3、4 和2。以最高的1-VR 和最低的SECV 選擇最優(yōu)的定標模型。不同營養(yǎng)成分光譜預處理方式及定標結果存在較大差異，其中干物質(zhì)、有機物、粗脂肪、粗蛋白、NDF、ADF 和ADL 最優(yōu)光譜預處理和導數(shù)處理分別為反向多元離散校正處理(inverse MSC)和1，4，4，1；標準正?；幚?SNV only)和1 ，4 ，4 ，1；二次處理 (scale and quadratic)和1，4，4，1；去散射處理(detrend only)和2，4，4，1；標準正?；幚砗?，4，4，1；標準多元離散校正處理(standard MSC)和1，4，4，1；加權多元離散校正處理(weighted MSC)。7 種營養(yǎng)成分對應的SECV 和1-VR 分別為：干物質(zhì)為0.536 3 和0.610 6；有機物為0.521 3 和0.9766；粗脂肪為0.387 0 和0.758 3；粗蛋白為0.433 8 和0.971 9；NDF 為1.412 1和0.987 9；ADF 為0.793 9 和0.992 4；ADL 為0.822 1和0.623 0 (表2)。

表2 青貯玉米定標結果Table 2 Calibration results for silage corn

2.3 青貯玉米預測模型外部驗證

有機物、粗蛋白、NDF 和ADF 4 種營養(yǎng)成分外部驗證的RSQV和RPD 分別為0.935 和3.836；0.952和4.619；0.967 和5.398；0.995 和13.347，RSQV和RPD均大于0.80 和2.50，這4 種營養(yǎng)成分的定標模型能夠用于實際生產(chǎn)中的準確預測。粗脂肪含量預測模型外部驗證的RSQV和RPD 為0.701 和1.838，該定標模型只能用于粗略的篩選分析(表3)。

表3 青貯玉米養(yǎng)分含量的預測結果Table 3 Prediction results for nutrient content in silage corn

干物質(zhì)和ADL 兩種營養(yǎng)成分外部驗證的RSQV和RPD 分別為0.525 和1.549、0.631 和1.602，這兩種營養(yǎng)成分預測模型效果較差，不能用于生產(chǎn)中的實際分析(圖2)。

圖2 營養(yǎng)指標含量預測值與濕化學分析值相關性分析Figure 2 Correlations between the predicted values and the chemical measured values for the nutrition indexes

3 討論

利用NIRS 在飼草料營養(yǎng)檢測的研究和應用已經(jīng)超過40年的歷史。Norris 等[24]首次以苜蓿、高羊茅(Festuca arundinacea)為研究對象，將NIRS 技術應用于牧草營養(yǎng)成分測定，檢測結果與濕化學分析值較為接近，證實利用NIRS 快速檢測牧草營養(yǎng)成分方法的可行性。近紅外光譜分析技術因其具有快速、方便、綠色環(huán)保等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應用于各個領域[25]。關于NIRS 在玉米秸稈品質(zhì)的快速檢測，前人做了大量研究。劉娜[26]利用NIRS 成功建立了全株玉米原料干物質(zhì)、有機物、粗蛋白、粗脂肪、NDF、ADF 和ADL 共7 種營養(yǎng)成分含量的近紅外預測模型，其決定系數(shù)均大于0.87。劉金明等[27]利用傅里葉近紅外光譜分析儀，對玉米秸稈樣品的纖維素和半纖維素的NIRS特征波長進行選擇構建定標模型，結果表明通過波長優(yōu)選構建的回歸模型性能顯著優(yōu)于全光譜段建模。劉海燕等[28]利用近紅外漫反射光譜技術測定了玉米秸稈不同部位(組織)的營養(yǎng)成分。穆懷彬等[29]建立了青貯玉米營養(yǎng)成分預測模型，均取得了較好的效果。

本研究采集227 個青貯玉米樣品，發(fā)現(xiàn)除了干物質(zhì)外，其余6 種營養(yǎng)成分包括有機物、粗脂肪、粗蛋白、NDF、ADF 和ADL 含量均差異較大，樣品代表性好，主要原因是采集的青貯玉米樣品來自于23 個品種、8 個收獲期、4 個部位。在利用NIRS對青貯玉米樣品干物質(zhì)、有機物、粗脂肪、粗蛋白、NDF、ADF 和ADL 含量進行定標和驗證過程中，其結果有所差異，這可能與物質(zhì)本身的化學結構相關聯(lián)[30]。另外，NIRS 屬于間接分析技術，建立模型的優(yōu)劣與濕化學分析方法的準確性有關。本研究中NDF 和ADF 的建模效果最好，這與白琪林[31]的研究結果一致，其發(fā)現(xiàn)建立的玉米秸稈NDF 和ADF 校正模型預測結果較好，校正決定系數(shù)均大于0.94，交叉驗證和外部驗證決定系數(shù)為0.92～0.96。產(chǎn)生這種建模效果的原因可能有：第一，ADF和NDF 含量較高，導致其主要的含氫基團能在近紅外光譜區(qū)產(chǎn)生明顯的吸收峰；第二，測定NDF和ADF 的儀器為ANKOM A200i 半自動纖維儀，平行測定重復數(shù)多達6 個，濕化學分析值較為準確。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)粗蛋白的模型預測能力僅次于NDF 和ADF，這與王新基等[32]報道結果一致，認為此結果主要緣于試驗中粗蛋白含量采用傳統(tǒng)的凱氏定氮法測定所致，此方法所檢測的氮元素為低價氮，而近紅外光譜只能掃描吸收低價氮，兩者匹配性較好[33]。粗脂肪和ADL 建模效果較差，這與郭濤[16]的結果相似?？赡芘c粗脂肪和ADL 在青貯玉米中含量較低有關，具體原因有待進一步分析。在所測定的7 個指標中，干物質(zhì)的定標及外部驗證效果最差，主要因本研究所用青貯玉米樣品干物質(zhì)含量變異性較小所致，光譜中的有效信息重疊，相應建立的定標模型和外部驗證結果均較差。

4 結論

本研究利用NIRS 建立了青貯玉米原料不同部位(組織)干物質(zhì)、有機物、粗脂肪、NDF、ADF、ADL和粗蛋白含量這7 種營養(yǎng)成分的近紅外預測模型。其中有機物、粗蛋白、NDF 和ADF 的預測模型可以用于實際生產(chǎn)中的準確分析，粗脂肪的預測模型只能用于樣品的粗略篩選分析。干物質(zhì)和ADL 的預測模型相關性較差，還需要進一步優(yōu)化。