付 寅，趙洪育，陳遠(yuǎn)才，李俊強(qiáng)，張龍現(xiàn)

畢氏腸微孢子蟲(chóng)(Enterocytozoonbieneusi)和芽囊原蟲(chóng)(Blastocystissp.)是2種常見(jiàn)的可引起人和多種動(dòng)物腸道疾病的重要人獸共患病病原。畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)廣泛存在于自然界的腸道寄生蟲(chóng)，主要通過(guò)糞口傳播，可感染包括人類在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物，主要引起腹瀉等消化道疾病[1-2]。畢氏腸微孢子蟲(chóng)還可引起宿主角膜炎、心肌炎、腦炎、泌尿系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病[3]，芽囊原蟲(chóng)為引起腸易激綜合征的重要病原體[4]。

基于畢氏腸微孢子蟲(chóng)ITS基因型至少可分成11個(gè)組(group)，其中g(shù)roup1為主要人獸共患基因型，其余的大部分有其宿主特異性。在?？苿?dòng)物中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)50種基因型，其中屬于group1中的D、Type IV、Peru6、CHN4、EbpA和group2中的基因型J、I、BEB4、BEB6、CHN3、CS-4、EbpC曾在人類中檢測(cè)到[5-6]。目前公認(rèn)芽囊原蟲(chóng)有17種亞型(ST1～ST17)，其中ST1～ST9和ST12曾在人類中檢出，ST3、ST5、ST6亞型在牛中較為常見(jiàn)[7-8]。

河南省為新興的奶業(yè)大省，近年來(lái)更加注重奶業(yè)發(fā)展，將發(fā)展奶業(yè)作為農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的重點(diǎn)。截至2020年，河南省奶牛存欄總量達(dá)34.2萬(wàn)頭，乳產(chǎn)品產(chǎn)量居全國(guó)前列。畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)作為奶牛中常見(jiàn)的腸道寄生蟲(chóng)，可造成奶牛生長(zhǎng)緩慢和產(chǎn)奶量下降甚至死亡[2-3]。本研究對(duì)河南地區(qū)奶牛微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)的感染情況及基因型分布進(jìn)行調(diào)查，評(píng)估河南奶牛微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)潛在的人獸共患病傳播風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 2019年7月到2020年7月期間，于河南省中牟、滎陽(yáng)、許昌、原陽(yáng)、新鄭5個(gè)行政區(qū)的10個(gè)奶牛場(chǎng)共采集1 020份奶牛新鮮糞樣。為避免交叉污染，每次采樣均使用一次性塑料袋收集，并記錄采樣地點(diǎn)和年齡信息，封存于一次性自封袋中，當(dāng)天運(yùn)送到河南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室，保存于4℃冰箱中待檢。

1.2 樣品分裝和DNA提取 所采集的糞便樣品，每份取200 mg轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，使用Stool DNA Kit(E.Z.N.A Stool DNA kit, OMEGA)提取糞便中病原的全基因組DNA，按照試劑盒推薦說(shuō)明書進(jìn)行操作，獲得的DNA保存于—20 ℃冰箱。

1.3 PCR檢測(cè) 畢氏腸微孢子蟲(chóng)基于ITS基因位點(diǎn)進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)，引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增參考Buckholt等發(fā)表的方法[9]。芽囊原蟲(chóng)基于SSU rRNA基因位點(diǎn)進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增參考Scicluna等發(fā)表的方法[10]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及退火溫度見(jiàn)表1。

表1 畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)引物序列Tab.1 Primer sequences for E. bieneusi and Blastocystis sp.

1.4 序列分析與基因型鑒定 陽(yáng)性PCR產(chǎn)物低溫運(yùn)送至北京諾賽基因有限公司，使用ABIPRISMTM 3730XL DNA測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。使用Chormas 2.6(https://chromas.software.informer.com)和MEGA 7.0(https://megasoftware.net)軟件對(duì)比校正雙向測(cè)序結(jié)果。將校正后的序列于NCBI GenBank(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列檢索以確定畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)的種類及基因型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用IBM SPSS Statistics 22軟件，采用χ2檢驗(yàn)分析不同地區(qū)及年齡段奶牛的畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)感染率的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各地區(qū)畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)感染率 對(duì)1 020份奶牛糞便樣本的DNA進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)，共檢測(cè)到221份畢氏腸微孢子蟲(chóng)陽(yáng)性樣品和196個(gè)芽囊原蟲(chóng)陽(yáng)性樣品，所有陽(yáng)性樣本均成功測(cè)序。通過(guò)將獲得的陽(yáng)性樣品序列在線Blast同源性比對(duì)均在98%～100%。結(jié)果顯示此次調(diào)查檢測(cè)的微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)感染率分別為21.7%(221/1 020)和19.2%(196/1 020)，其中2種病原的混合感染率為3.5%(36/1 020)。

不同地區(qū)奶牛畢氏腸微孢子蟲(chóng)的檢出率，中牟地區(qū)(31.8%,68/214)顯著大于滎陽(yáng)(19.1%,81/424)(χ2=12.758,P<0.01)和新鄭(17.3%,19/110)(χ2=7.780,P<0.01)。許昌和原陽(yáng)地區(qū)畢氏腸微孢子蟲(chóng)的檢出率分別為22.4%(15/67)和18.5%(38/205)。

不同地區(qū)奶牛芽囊原蟲(chóng)檢出率，滎陽(yáng)地區(qū)(34.0%，144/424)明顯大于中牟(10.3%，22/214)(χ2=41.436，P<0.001)、原陽(yáng)(1.5%，3/205)(χ2=81.497，P<0.001)、新鄭(12.7%，14/110)(χ2=18.904，P<0.001)和許昌(19.4%，13/67)(χ2=5.638，P=0.018)。而原陽(yáng)地區(qū)明顯低于中牟(χ2=14.507，P<0.001)、滎陽(yáng) (χ2=81.497，P<0.001)、許昌(χ2=29.354，P<0.001)、新鄭(χ2=17.790，P<0.001)4個(gè)地區(qū)。河南省這 5個(gè)地區(qū)奶牛場(chǎng)畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)檢出率及基因型分布詳見(jiàn)表2。

表2 各養(yǎng)殖場(chǎng)畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)感染率和基因型Tab.2 Prevalence and genotypes of E. bieneusi and Blastocystis sp. in different farms

2.2 各年齡段奶牛畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)感染率 分析不同年齡段奶牛畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)感染率發(fā)現(xiàn)，6月齡以上的畢氏微孢子蟲(chóng)感染率13.0%(71/548)，明顯低于6月齡以下奶牛的感染率31.8%(150/472)(χ2=52.940,P<0.001)，6月齡以內(nèi)奶牛畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染率較高；芽囊原蟲(chóng)在4個(gè)年齡段感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=45.013,P<0.01)，其中1～6月齡和12月齡以上的奶牛芽囊原蟲(chóng)感染率較高(圖1、圖2)。

注：柱狀圖表示不同基因型畢氏腸微孢子蟲(chóng)陽(yáng)性數(shù)量，折線圖反映各年齡段感染率變化。圖1 各年齡段奶牛畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染率及基因型Fig.1 Infection and genotype distribution of E. bieneusi in different age groups

注：柱狀圖表示不同基因型芽囊原蟲(chóng)陽(yáng)性數(shù)量，折線圖反映各年齡段感染率變化。圖2 各年齡段奶牛芽囊原蟲(chóng)感染率及基因型Fig.2 Infection and genotype distribution of Blastocystis sp. in different age groups

2.3 畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)序列分析及基因型鑒定 畢氏腸微孢子蟲(chóng)共檢測(cè)到9種基因型，分別為J(126)、BEB4(25)、BEB6(22)、HNWW2(21)、I(16)、D(6)、CHG2(4)、NHD1(2)、EbpA(2)。其中基因型J為優(yōu)勢(shì)基因型，占比57.0%，其次為基因型BEB4(11.3%)、BEB6(10.0%)、HNWW2(9.5%)和I(7.2%)。

芽囊原蟲(chóng)共檢測(cè)出6種基因型，分別為ST10(111)、ST5(39)、ST14(37)、ST4(6)、ST2(2)、ST1(1)。其中ST10占比56.6%，為此次調(diào)查研究的芽囊原蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)基因型，隨后為ST5(19.9%)和ST14(18.9%)。

3 討 論

畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)在世界范圍內(nèi)感染人類和多種哺乳動(dòng)物，本次調(diào)查顯示河南地區(qū)奶牛畢氏腸微孢子蟲(chóng)總體感染率為21.7%(221/1 020)，Zhang等[11]報(bào)道顯示全世界?？苿?dòng)物畢氏腸微孢子蟲(chóng)的感染率為3.1%～37.6%，此次調(diào)查結(jié)果也在此范圍內(nèi)。本研究顯示奶牛微孢子蟲(chóng)感染率與年齡相關(guān)，成年牛和育成牛感染率大于犢牛，這與從前的報(bào)道相符合[13-16]。報(bào)道顯示畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染率還與糞便狀態(tài)、養(yǎng)殖模式、季節(jié)等因素有關(guān)，腹瀉樣品相對(duì)于正常糞便樣品更易檢出，圈養(yǎng)奶牛感染微孢子蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)顯著低于放養(yǎng)奶牛[12]，微孢子蟲(chóng)在秋季的檢出率顯著低于春季[11]。樣品采集的季節(jié)以及樣品中來(lái)源于放養(yǎng)奶牛的比例、各年齡段奶牛所占比例是造成感染率差異的部分影響因素。

本研究調(diào)查河南地區(qū)奶牛芽囊原蟲(chóng)感染率為19.2%(196/1 020)，顯著高于東北地區(qū)奶牛的感染率10.3%(54/526)[17]和黑龍江地區(qū)感染率9.5%(14/147)[18]，以及廣東地區(qū)的感染率1.88%(9/479)[19]。世界各國(guó)奶牛芽囊原蟲(chóng)感染率為2.9%～54.1%[20-23]。報(bào)道顯示3—12月齡牛感染率較高[21]，6月齡以上的牦牛感染率較高[24]，此次研究顯示1—6月齡及12月齡以上奶牛感染率較高，不同年齡段奶牛芽囊原蟲(chóng)感染率沒(méi)有明顯的線性關(guān)系，該結(jié)論與兩者研究結(jié)論不盡相同，但部分重疊；夏季的牛芽囊原蟲(chóng)檢出率顯著高于其他季節(jié)[21-24]，正常糞便芽囊原蟲(chóng)檢出率顯著高于水樣糞便和血樣糞便等其他糞便類型[21]。奶牛芽囊原蟲(chóng)感染率可能受年齡、季節(jié)以及糞便狀態(tài)影響，但具體的規(guī)律仍需要更多的研究進(jìn)一步證明。

本次調(diào)查研究共檢測(cè)出9種畢氏腸微孢子蟲(chóng)ITS基因型(D、J、I、BEB4、BEB6、NHD1、HNWW2、CHG2、EbpA)，其中5種為潛在的人獸共患基因型，分別為屬于group1的基因型D(6例)和group2的基因型J(126例)、I(16例)、BEB4(25例)、BEB6(22例)。畢氏腸微孢子蟲(chóng)亞型J分布范圍最廣，檢出率占比最高(57.0%)，為此次研究中畢氏腸微孢子蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)基因型。與之前的報(bào)道一致[11]。本次調(diào)查共檢測(cè)出6種芽囊原蟲(chóng)基因型(ST1、ST2、ST4、ST5、ST10、ST14)，其中ST1、ST2、ST4、ST5為人獸共患基因型，ST1和ST2僅檢測(cè)到1例，ST4檢測(cè)到5例，ST5檢測(cè)到35例。芽囊原蟲(chóng)ST10檢出率占比最高(56.6%)為此次研究中的優(yōu)勢(shì)基因型；而人獸共患基因型ST5在5個(gè)地區(qū)奶牛場(chǎng)中均有檢出。

不同年齡段奶牛的畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)感染情況有所差異，并且6月齡以內(nèi)的奶牛畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染率較高；而芽囊原蟲(chóng)感染率在各個(gè)年齡段差異顯著，但是沒(méi)有觀察到明顯的分布規(guī)律，畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)均主要通過(guò)糞口傳播，并且作為機(jī)會(huì)致病性病原，對(duì)免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟的犢牛危害較大，因此應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)犢牛的管理，及時(shí)清理糞便，勤換墊料。

本研究對(duì)河南省奶牛畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)流行情況進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查研究，首次報(bào)道了河南省奶牛芽囊原蟲(chóng)的流行及基因分布情況。畢氏腸微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)在各個(gè)年齡段奶牛中均有檢出，且有人獸共患基因型檢出，表示河南地區(qū)奶牛微孢子蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)有人獸共患風(fēng)險(xiǎn)，需做好防控措施。