李 娜，劉 輝，李 健，劉 銘，姜慧鈺，陳 瀟，關(guān)恒云，劉嵐錚，張京云

沙門氏菌是能引起感染者腹瀉的重要人獸共患病原菌之一，也是引起細(xì)菌性食物中毒的主要病原體之一，其分布廣泛且血清型眾多[1]，然而，不同血清型的沙門氏菌的致病性和對抗生素的敏感性不同，因而沙門氏菌的血清分型以及耐藥分析對于臨床治療和研究具有重大意義[2]。脈沖場凝膠電泳(PFGE)是一種研究菌株同源性的有效方法，是國際公認(rèn)的追蹤溯源的金標(biāo)準(zhǔn)，對于細(xì)菌性傳染病的監(jiān)測及細(xì)菌性傳染病疫情暴發(fā)的病原識別、追蹤溯源有著非常重要的意義[3]。

近年來，由于抗生素的濫用導(dǎo)致了許多耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，甚至出現(xiàn)了多重耐藥細(xì)菌或者全耐藥超級細(xì)菌，沙門氏菌作為重要的致病菌，其耐藥性不容忽視[4-5]。本研究以濟南市各哨點醫(yī)院腹瀉門診患者中分離到的沙門氏菌為研究對象，進(jìn)行PFGE分子分型和藥敏試驗，為控制沙門氏菌在濟南地區(qū)的傳播和進(jìn)行臨床治療提供相關(guān)理論依據(jù)，同時為實驗室監(jiān)測、鑒定溯源及防控預(yù)警提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來源 本實驗中90株沙門氏菌均分離自濟南市哨點醫(yī)院腹瀉門診患者的糞便標(biāo)本。脈沖場凝膠電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)菌株為沙門氏菌H9812，取自山東省疾病預(yù)防控制中心細(xì)菌所。藥敏實驗質(zhì)控菌株ATCC25922購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基和儀器試劑 沙門氏菌顯色平板購自CHROMagar；營養(yǎng)瓊脂，XLD瓊脂均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；沙門氏菌屬診斷血清購自丹麥國家食品研究所；革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡、VITEK2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)以及比濁儀(bioMerieus Vitek colorimeter)均購自梅里埃生物有限公司；A3A4藥敏板購自上海星佰生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ購自TaKaRa公司；蛋白酶K購自MERCK公司；Gelred購自Biotium公司；脈沖場凝膠電泳儀購自BIO-RID公司。

1.2 方 法

1.2.1 沙門氏菌的血清學(xué)分型 根據(jù)沙門氏菌血清型屬White-Kauffmann Le Minor抗原表,利用玻片凝集法對90株沙門氏菌進(jìn)行O抗原和H抗原血清凝集試驗確定菌株的血清型別。

1.2.2 PFGE分子分型 參照美國疾病預(yù)防控制中心Pulse Net PFGE標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行[2]，將90株分離的沙門菌株用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后進(jìn)行脈沖場凝膠電泳技術(shù)(PFGE)，膠塊經(jīng)Gelred染液染色后成像，再將脈沖場電泳圖譜導(dǎo)入BioNumerics軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類樹，分析菌株間的相似性。

1.2.3 藥物敏感試驗 利用微量肉湯稀釋法定量測定90株沙門氏菌對以下14種抗生素的藥物敏感性：環(huán)丙沙星(CIP)、氨芐西林(AMP)、四環(huán)素(TET)、氯霉素(CHL)、復(fù)方新諾明(SXT)、頭孢他啶(CAZ)、慶大霉素(GEN)、萘啶酸(NAL)、磺胺異噁唑(Sul)、頭孢吡肟(FEP)、左氧氟沙星(LEV)、多西環(huán)素(DOX)、鏈霉素(STR)、亞胺培南(IMI)。根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)獲得相應(yīng)敏感(S)、中度敏感(I)和耐藥(R)的結(jié)果[2]。

2 結(jié) 果

2.1 沙門氏菌血清分型 對90株沙門氏菌進(jìn)行血清學(xué)鑒定，共鑒定出27個血清型，主要為鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌，分別為43株和16株。

表1(續(xù))血清型抗原式菌株數(shù)占比/%姆班達(dá)卡沙門氏菌6,7:z10:e,n,z1511.11斯坦利沙門氏菌4,5,12:d:1,211.11奧拉寧堡沙門氏菌6,7:m,t:-11.11雛生化沙門氏菌9,12:-:-11.11特西翁闊沙門氏菌6,8:e,h:e,n,z1511.11門登沙門氏菌6,7:z10:1,222.22科羅拉多沙門氏菌6,7:l,w:1,511.11金斯敦沙門氏菌4,12:g,s,t:-11.11丘古沙門氏菌6,7:z10:e,n,x11.11福爾斯布特爾沙門氏菌3,10:l,v:z611.11

2.2 脈沖場凝膠電泳及聚類分析 將90株分離的沙門菌株用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后進(jìn)行脈沖場凝膠電泳技術(shù)(PFGE)，膠塊經(jīng)Gelred染液染色后成像，90株沙門氏菌帶型相似度在49%～100%(圖1)。同一血清型沙門氏菌大部分菌株P(guān)FGE圖譜可聚集成簇，但腸炎沙門氏菌與都柏林沙門氏菌PFGE圖譜相似度較高，2種血清型菌株部分聚集成簇存在(圖1)。

圖1 90株沙門氏菌PFGE聚類分析圖譜Fig.1 PFGE analysis of 90 Salmonella isolates

2.3 藥敏試驗結(jié)果 通過肉湯稀釋法隨機抽取40株沙門氏菌做藥物敏感試驗，結(jié)果顯示其對氨芐西林耐藥率最高，其次是萘啶酸、磺胺異噁唑、四環(huán)素、多西環(huán)素和鏈霉素，對頭孢類抗生素較為敏感，對亞胺培南最敏感，敏感率為100%(表2)。

表2 40株沙門氏菌對14種抗生素的耐藥情況Tab.2 Resistance of 40 Salmonella isolates to 14 antibiotics

40株沙門氏菌中只有8株對14種抗生素完全敏感，其余32株菌都有不同程度耐藥(表3)。

表3 40株沙門氏菌耐藥譜Tab.3 Drug-resistance spectrum of 40 strains of Salmonella

3 討 論

感染性腹瀉一直是重要的公共衛(wèi)生問題，也是發(fā)展中國家常見的一種傳染病[6-7]，每年約有6億人發(fā)病，其中沙門氏菌是引起感染性性腹瀉最常見的致病菌[7]，也是濟南地區(qū)引起食物中毒的主要病原菌之一，沙門氏菌菌型繁多，迄今已發(fā)現(xiàn)2 500多個血清型[8]。本次研究中濟南市共鑒定出27個血清型，主要優(yōu)勢血清型別為鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌，這與國際及國內(nèi)其他研究結(jié)果一致[1-2,7,9-11]，特別是鼠傷寒沙門氏菌[12]，已成為濟南地區(qū)最常見的血清型；不同的是濟南地區(qū)的沙門氏菌血清型更復(fù)雜多樣，且近年來頻繁發(fā)生一些由罕見血清型引起的腹瀉病例或者食物中毒事件[13]；且不同血清型沙門氏菌的致病性、臨床表現(xiàn)以及流行病學(xué)特征值得我們進(jìn)一步深入研究。

沙門菌污染食品致腹瀉暴發(fā)由以前的點源性集中暴發(fā)，越來越多地轉(zhuǎn)變?yōu)榭绲貐^(qū)跨州(省)的散在暴發(fā)形式出現(xiàn)，使污染源及傳播途徑的發(fā)現(xiàn)存在一定難度[14]。目前，單純的沙門氏菌血清分型鑒定已經(jīng)滿足不了復(fù)雜的食源性疾病診斷及對病原體進(jìn)行溯源分析的需求，脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來一種非常有效的分子分型的方法，被譽為細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[15-17]。本研究中的PFGE分子分型結(jié)果顯示，濟南地區(qū)沙門氏菌帶型多樣具有多態(tài)性，以鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的帶型最為集中，且無地域和時間的聚集性，說明近年來濟南市無沙門氏菌既往暴發(fā)，但由于分離菌株數(shù)量較少，尚需不斷擴大監(jiān)測范圍，不斷建立并完善沙門氏菌PFGE分型數(shù)據(jù)庫，為下一步為實驗室監(jiān)測、鑒定溯源及防控預(yù)警提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)參考。

近年來，由于抗生素的濫用導(dǎo)致了許多耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生[18]，甚至出現(xiàn)了多重耐藥細(xì)菌或者全耐藥超級細(xì)菌，從而使越來越多的患者對抗生素產(chǎn)生耐藥[12,19-21]。感染患者的高病死率和缺乏有效抗感染藥物的現(xiàn)狀對臨床治療提出了挑戰(zhàn)。本研究結(jié)果顯示只有20%的菌株對14種抗生素完全敏感，其余80%的菌株都有不同程度的耐藥，對氨芐西林耐藥率高達(dá)72.55%，其次是萘啶酸、磺胺異噁唑、四環(huán)素、多西環(huán)素和鏈霉素，耐藥率分別為65%、60%、55%、47.50%和55%。另外，沙門氏菌多重耐藥現(xiàn)象非常明顯，多重耐藥率達(dá)67.50%，與聊城地區(qū)、上海地區(qū)及云南省等多地區(qū)多重耐藥率相差不大[2,4,7,9,12,14]，但濟南地區(qū)的多重耐藥程度卻是最嚴(yán)重的，從耐藥譜來看40株菌共產(chǎn)生21個耐藥譜，優(yōu)勢耐藥譜為AMP+TET+NAL+Sul+DOX+STR，藥物種類達(dá)到6種，相對其他省市來看，濟南市耐藥形式更為嚴(yán)重，其中耐4種及以上抗生素的有25株，占62.50%(表3)，約半數(shù)菌株對6種及以上抗生素產(chǎn)生耐藥，2株鼠傷寒沙門氏菌和1株病牛沙門氏菌對9種抗生素產(chǎn)生耐藥，還有1株印第安納沙門氏菌對13種抗生素耐藥，這是在國內(nèi)沙門氏菌研究中非常罕見的，這些提示濟南市沙門氏菌的耐藥形勢非常嚴(yán)峻，對耐藥結(jié)果應(yīng)進(jìn)行深入的流行病學(xué)調(diào)查及分子生物學(xué)研究，以了解沙門氏菌菌株多重耐藥原因，為解決沙門氏菌的耐藥問題提供科學(xué)依據(jù)。

總之，本研究初步建立了濟南市腹瀉人群腸道沙門氏菌PFGE分子分型數(shù)據(jù)庫，為今后的流行病學(xué)溯源及防控預(yù)警奠定了基礎(chǔ)。與此同時，濟南地區(qū)沙門氏菌的耐藥現(xiàn)象不容忽視，且不同血清型的沙門氏菌耐藥譜不同，臨床應(yīng)合理規(guī)范使用抗生素并加強耐藥監(jiān)測。另外，疾控部門、醫(yī)院和食藥監(jiān)部門應(yīng)加強合作，加大對食品的檢測力度及并規(guī)范抗生素的合理使用，為食源性疾病的防治提供堅強后盾。