張維義 夏維 苑廣超 王芳 江輝 范李

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)約占原發(fā)性肝癌的75%～85%。吸入麻醉劑七氟烷被廣泛用于臨床的肝癌手術，但對肝細胞癌的作用尚無定論[1]。糖酵解在肝癌的惡性表型維持中起著關鍵作用。近年來，一種新型非編碼RNA BACE1-AS(BACE1 Antisense RNA)被認為參與了多種腫瘤的進展[2]。本研究通過觀察七氟烷對肝癌細胞增殖、凋亡、侵襲遷移以及糖酵解的影響，同時觀察七氟烷對BACE1-AS表達的影響。

材料和方法

一、材料

肝癌細胞系(HepG2、Sk-Hep-1、SMMC-7721)和永生化人胎肝細胞系(L02/HL-7702)購自中國科學院上海生物科學研究所。細胞在含有10%(v/v)熱滅活胎牛血清(FBS；Gibco，Gaithersburg，MD)的DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher Science Life Sciences，Waltham，MA)培養(yǎng)。細胞接種于37 ℃的組織培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱內(nèi)含5%CO2。用4%濃度的七氟烷(Sigma，St.Louis，MO)刺激細胞24小時。

二、方法

1.細胞增殖檢測：用CCK-8(Dojindo公司)檢測肝癌細胞細胞增殖率。將細胞播種到96孔板中，經(jīng)七氟烷刺激后，每孔加入CCK-8溶液，37 ℃、95%空氣和5%CO2的濕化氣氛中孵育1小時。用微板閱讀器(Bio-Rad，Hercules，CA)在450 nm處檢測吸光度。實驗重復3次。

2.細胞凋亡檢測：細胞經(jīng)過七氟烷刺激后，用Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測試劑盒按照制造商的描述檢測細胞凋亡進程。在50 μg/ml核糖核酸酶A(SIGMA)存在下，用Annexin V-FITC/碘化丙啶(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide)在黑暗中對細胞進行染色。隨后，在FACScan流式細胞儀(Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA)上檢測細胞凋亡結果，實驗重復3次。

3.Transwell侵襲和遷移實驗：將1 000個細胞接種到六孔板中，并在含有10% FBS的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將乳腺癌細胞用4%多聚甲醛固定30分鐘，用0.1%結晶紫染色30分鐘。手工計數(shù)可見克隆數(shù)。將懸浮細胞加入含有1%胎牛血清的上室，而下室含有10%胎牛血清。孵育后，將侵入下腔的細胞固定，顯微鏡下染色計數(shù)。上室加入基質膠后，將100 μl含有1%胎牛血清的培養(yǎng)基懸浮的乳腺癌細胞加入上室，下室含有10%胎牛血清。孵育后，將侵入小室的細胞固定，顯微鏡下染色計數(shù)。

4.細胞劃痕實驗：待六孔板里的細胞鋪滿后，用槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕，將細胞接種與中間區(qū)域然后培養(yǎng)，帶細胞長滿區(qū)域后用鑷子移除既可以觀察到劃痕。

5.生物信息學：利用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫對BACE1-AS的相關生物學信息進行挖掘，包括肝癌組織中的表達量，預后相關分析等。

三、統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件(GraphPad Software，California)進行統(tǒng)計分析。比較結果使用非配對雙尾t檢驗或單方差分析，然后進行Bonferroni后檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1.七氟烷對肝癌細胞增殖和凋亡的影響：與未處理細胞比較，七氟烷刺激明顯降低HepG2細胞的存活率(P<0.05，圖1A)。此外，我們觀察到七氟烷是一種有效的促凋亡因子(P<0.05，圖1B)。以上結果表明，七氟烷可以抑制肝癌細胞的生長，同時具有促進肝癌細胞凋亡的特性。

2.七氟烷對肝癌細胞侵襲遷移的影響：Transwell實驗表明，與未處理細胞比較，七氟烷刺激明顯降低HepG2細胞的侵襲力(P<0.05，圖2A)。此外，劃痕實驗表明，經(jīng)過七氟烷處理，HepG2細胞的遷移能力下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2B)。以上結果表明，七氟烷可以抑制肝癌細胞的侵襲和遷移。

3.七氟烷對肝癌細胞糖酵解的影響：與未處理細胞比較，七氟烷刺激降低HepG2細胞的葡萄糖攝取以及乳酸生成(P<0.05，圖3A)。此外，經(jīng)過七氟烷處理，HepG2細胞的細胞外酸化(ECAR)明顯下降，而耗氧量(OCR)明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3B)。以上結果表明，七氟烷可以抑制肝癌細胞的糖酵解。

4.七氟烷降低癌基因BACE1-AS的表達：研究表明，非編碼RNA BACE1-AS是多種腫瘤的癌基因。我們通過挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，BACE1-AS在肝癌組織中的表達均高于對照組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4A)。此外，高表達BACE1-AS的肝癌病人生存期明顯更短，風險比達1.75，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4B)。另外，BACE1-AS在3種肝癌細胞中的表達高于正常肝細胞(P<0.05，圖4C)，而經(jīng)過七氟烷處理后，肝癌細胞BACE1-AS的表達降低(P<0.05，圖4D)。結果表明，BACE1-AS是一個肝細胞癌癌基因，七氟烷可以抑制其表達。

A：七氟烷抑制肝癌細胞的增殖；B：七氟烷促進肝癌細胞的凋亡

A：七氟烷抑制肝癌細胞的侵襲；B：七氟烷抑制肝癌細胞的遷移

討論

七氟烷是臨床上一種常用揮發(fā)性麻醉劑。有研究表明，七氟烷在許多人類癌癥中顯示出抗癌活性。如，七氟烷通過抑制絲裂原相關蛋白激酶途徑的激活來抑制肺癌細胞的侵襲[3]。研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷通過誘導A549細胞凋亡來抑制增殖[4]。同時七氟烷通過下調MMP9在體外降低結腸癌細胞的侵襲力[5]。此外，七氟烷通過抑制缺氧誘導因子-1α(HIF-1a)而抑制缺氧誘導的肺癌細胞生長和轉移[6]。七氟烷對膠質瘤細胞的遷移和MMP-2活性有抑制作用[7]。然而，很少有報道涉及七氟烷在肝癌中的作用。本研究結果表明，七氟烷明顯抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移，同時促進其凋亡。

A：七氟烷降低HepG2細胞的葡萄糖攝取以及乳酸的生成；B：經(jīng)過七氟烷處理，HepG2細胞的細胞外酸化(ECAR)明顯下降，而耗氧量(OCR)明顯上升

A：BACE1-AS在肝癌組織中高表達；B：高表達BACE1-AS提示較差的預后；C：BACE1-AS在肝細胞癌細胞系中高表達；D：七氟烷可以降低BACE1-AS的表達

目前最新觀點認為腫瘤細胞即使在充足的氧氣條件下也傾向于將葡萄糖轉化為乳酸，這種現(xiàn)象被稱為有氧糖酵解或Warburg效應，其特征是葡萄糖攝取和乳酸生成增加，細胞外酸化率的增加，而耗氧量降低[8]。在肝癌的進展過程中，有氧糖酵解可以促進惡性表型，乳酸的產(chǎn)生為肝癌的侵襲和轉移提供了酸性環(huán)境[9]；有氧糖酵解的增加也與索拉非尼耐藥有關[10]。因此，糖酵解是肝癌細胞一個顯著的特征，也是潛在的治療靶點。我們的研究結果表明，經(jīng)過七氟烷處理后，HepG2細胞的葡萄糖攝取以及乳酸的生成明顯下降，細胞外酸化明顯下降，而耗氧量明顯上升，提示七氟烷可以逆轉肝癌細胞的有氧糖酵解。

長非編碼RNA(Long Non-Coding RNAs，LncRNAs)是一組長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，已被報道參與包括肝癌在內(nèi)的人類腫瘤相關。例如，lncRNA RHPN1-AS1(RHPN1 Antisense RNA 1)通過阻斷miR-596對IGF2BP2(Insulin Like Growth Factor 2 MRNA Binding Protein 2)表達的抑制來推動肝癌的進展[11]。LncRNA SSTR5-AS1(SSTR5 Antisense RNA 1)參與了HBV相關肝癌的發(fā)展[12]。近年來，一種新型非編碼RNA BACE1-AS(BACE1 Antisense RNA)被認為參與了多種腫瘤的進展[13]。本研究結果表明，BACE1-AS是一個肝細胞癌相關癌基因，經(jīng)過七氟烷處理后，肝癌細胞BACE1-AS的表達明顯降低。

本研究總結了七氟烷在調節(jié)BACE1-AS通路中的新作用，并在體外發(fā)揮其抗腫瘤活性。然而，本研究還存在一定的局限性，還需要更多的體內(nèi)實驗來證實BACE1-AS介導的七氟烷在肝癌中的抗腫瘤活性，以及BACE1-AS下游的分子靶點及具體機制。

綜上所述，七氟烷可能通過下調BACE1-AS的表達，抑制肝癌細胞的增殖、侵襲遷移和糖酵解，同時促進其凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。