張維義 夏維 苑廣超 王芳 江輝 范李
肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)約占原發(fā)性肝癌的75%~85%。吸入麻醉劑七氟烷被廣泛用于臨床的肝癌手術(shù),但對肝細(xì)胞癌的作用尚無定論[1]。糖酵解在肝癌的惡性表型維持中起著關(guān)鍵作用。近年來,一種新型非編碼RNA BACE1-AS(BACE1 Antisense RNA)被認(rèn)為參與了多種腫瘤的進(jìn)展[2]。本研究通過觀察七氟烷對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移以及糖酵解的影響,同時(shí)觀察七氟烷對BACE1-AS表達(dá)的影響。
肝癌細(xì)胞系(HepG2、Sk-Hep-1、SMMC-7721)和永生化人胎肝細(xì)胞系(L02/HL-7702)購自中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所。細(xì)胞在含有10%(v/v)熱滅活胎牛血清(FBS;Gibco,Gaithersburg,MD)的DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher Science Life Sciences,Waltham,MA)培養(yǎng)。細(xì)胞接種于37 ℃的組織培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)箱內(nèi)含5%CO2。用4%濃度的七氟烷(Sigma,St.Louis,MO)刺激細(xì)胞24小時(shí)。
1.細(xì)胞增殖檢測:用CCK-8(Dojindo公司)檢測肝癌細(xì)胞細(xì)胞增殖率。將細(xì)胞播種到96孔板中,經(jīng)七氟烷刺激后,每孔加入CCK-8溶液,37 ℃、95%空氣和5%CO2的濕化氣氛中孵育1小時(shí)。用微板閱讀器(Bio-Rad,Hercules,CA)在450 nm處檢測吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.細(xì)胞凋亡檢測:細(xì)胞經(jīng)過七氟烷刺激后,用Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測試劑盒按照制造商的描述檢測細(xì)胞凋亡進(jìn)程。在50 μg/ml核糖核酸酶A(SIGMA)存在下,用Annexin V-FITC/碘化丙啶(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide)在黑暗中對細(xì)胞進(jìn)行染色。隨后,在FACScan流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter,F(xiàn)ullerton,CA)上檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
3.Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn):將1 000個(gè)細(xì)胞接種到六孔板中,并在含有10% FBS的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將乳腺癌細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30分鐘,用0.1%結(jié)晶紫染色30分鐘。手工計(jì)數(shù)可見克隆數(shù)。將懸浮細(xì)胞加入含有1%胎牛血清的上室,而下室含有10%胎牛血清。孵育后,將侵入下腔的細(xì)胞固定,顯微鏡下染色計(jì)數(shù)。上室加入基質(zhì)膠后,將100 μl含有1%胎牛血清的培養(yǎng)基懸浮的乳腺癌細(xì)胞加入上室,下室含有10%胎牛血清。孵育后,將侵入小室的細(xì)胞固定,顯微鏡下染色計(jì)數(shù)。
4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):待六孔板里的細(xì)胞鋪滿后,用槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕,將細(xì)胞接種與中間區(qū)域然后培養(yǎng),帶細(xì)胞長滿區(qū)域后用鑷子移除既可以觀察到劃痕。
5.生物信息學(xué):利用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫對BACE1-AS的相關(guān)生物學(xué)信息進(jìn)行挖掘,包括肝癌組織中的表達(dá)量,預(yù)后相關(guān)分析等。
使用GraphPad Prism 8.0軟件(GraphPad Software,California)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較結(jié)果使用非配對雙尾t檢驗(yàn)或單方差分析,然后進(jìn)行Bonferroni后檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1.七氟烷對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響:與未處理細(xì)胞比較,七氟烷刺激明顯降低HepG2細(xì)胞的存活率(P<0.05,圖1A)。此外,我們觀察到七氟烷是一種有效的促凋亡因子(P<0.05,圖1B)。以上結(jié)果表明,七氟烷可以抑制肝癌細(xì)胞的生長,同時(shí)具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的特性。
2.七氟烷對肝癌細(xì)胞侵襲遷移的影響:Transwell實(shí)驗(yàn)表明,與未處理細(xì)胞比較,七氟烷刺激明顯降低HepG2細(xì)胞的侵襲力(P<0.05,圖2A)。此外,劃痕實(shí)驗(yàn)表明,經(jīng)過七氟烷處理,HepG2細(xì)胞的遷移能力下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2B)。以上結(jié)果表明,七氟烷可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。
3.七氟烷對肝癌細(xì)胞糖酵解的影響:與未處理細(xì)胞比較,七氟烷刺激降低HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取以及乳酸生成(P<0.05,圖3A)。此外,經(jīng)過七氟烷處理,HepG2細(xì)胞的細(xì)胞外酸化(ECAR)明顯下降,而耗氧量(OCR)明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3B)。以上結(jié)果表明,七氟烷可以抑制肝癌細(xì)胞的糖酵解。
4.七氟烷降低癌基因BACE1-AS的表達(dá):研究表明,非編碼RNA BACE1-AS是多種腫瘤的癌基因。我們通過挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),BACE1-AS在肝癌組織中的表達(dá)均高于對照組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4A)。此外,高表達(dá)BACE1-AS的肝癌病人生存期明顯更短,風(fēng)險(xiǎn)比達(dá)1.75,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4B)。另外,BACE1-AS在3種肝癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常肝細(xì)胞(P<0.05,圖4C),而經(jīng)過七氟烷處理后,肝癌細(xì)胞BACE1-AS的表達(dá)降低(P<0.05,圖4D)。結(jié)果表明,BACE1-AS是一個(gè)肝細(xì)胞癌癌基因,七氟烷可以抑制其表達(dá)。
A:七氟烷抑制肝癌細(xì)胞的增殖;B:七氟烷促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡
A:七氟烷抑制肝癌細(xì)胞的侵襲;B:七氟烷抑制肝癌細(xì)胞的遷移
七氟烷是臨床上一種常用揮發(fā)性麻醉劑。有研究表明,七氟烷在許多人類癌癥中顯示出抗癌活性。如,七氟烷通過抑制絲裂原相關(guān)蛋白激酶途徑的激活來抑制肺癌細(xì)胞的侵襲[3]。研究發(fā)現(xiàn),七氟烷通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡來抑制增殖[4]。同時(shí)七氟烷通過下調(diào)MMP9在體外降低結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲力[5]。此外,七氟烷通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1a)而抑制缺氧誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[6]。七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和MMP-2活性有抑制作用[7]。然而,很少有報(bào)道涉及七氟烷在肝癌中的作用。本研究結(jié)果表明,七氟烷明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,同時(shí)促進(jìn)其凋亡。
A:七氟烷降低HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取以及乳酸的生成;B:經(jīng)過七氟烷處理,HepG2細(xì)胞的細(xì)胞外酸化(ECAR)明顯下降,而耗氧量(OCR)明顯上升
A:BACE1-AS在肝癌組織中高表達(dá);B:高表達(dá)BACE1-AS提示較差的預(yù)后;C:BACE1-AS在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系中高表達(dá);D:七氟烷可以降低BACE1-AS的表達(dá)
目前最新觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤細(xì)胞即使在充足的氧氣條件下也傾向于將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸,這種現(xiàn)象被稱為有氧糖酵解或Warburg效應(yīng),其特征是葡萄糖攝取和乳酸生成增加,細(xì)胞外酸化率的增加,而耗氧量降低[8]。在肝癌的進(jìn)展過程中,有氧糖酵解可以促進(jìn)惡性表型,乳酸的產(chǎn)生為肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了酸性環(huán)境[9];有氧糖酵解的增加也與索拉非尼耐藥有關(guān)[10]。因此,糖酵解是肝癌細(xì)胞一個(gè)顯著的特征,也是潛在的治療靶點(diǎn)。我們的研究結(jié)果表明,經(jīng)過七氟烷處理后,HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取以及乳酸的生成明顯下降,細(xì)胞外酸化明顯下降,而耗氧量明顯上升,提示七氟烷可以逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的有氧糖酵解。
長非編碼RNA(Long Non-Coding RNAs,LncRNAs)是一組長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA,已被報(bào)道參與包括肝癌在內(nèi)的人類腫瘤相關(guān)。例如,lncRNA RHPN1-AS1(RHPN1 Antisense RNA 1)通過阻斷miR-596對IGF2BP2(Insulin Like Growth Factor 2 MRNA Binding Protein 2)表達(dá)的抑制來推動肝癌的進(jìn)展[11]。LncRNA SSTR5-AS1(SSTR5 Antisense RNA 1)參與了HBV相關(guān)肝癌的發(fā)展[12]。近年來,一種新型非編碼RNA BACE1-AS(BACE1 Antisense RNA)被認(rèn)為參與了多種腫瘤的進(jìn)展[13]。本研究結(jié)果表明,BACE1-AS是一個(gè)肝細(xì)胞癌相關(guān)癌基因,經(jīng)過七氟烷處理后,肝癌細(xì)胞BACE1-AS的表達(dá)明顯降低。
本研究總結(jié)了七氟烷在調(diào)節(jié)BACE1-AS通路中的新作用,并在體外發(fā)揮其抗腫瘤活性。然而,本研究還存在一定的局限性,還需要更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)BACE1-AS介導(dǎo)的七氟烷在肝癌中的抗腫瘤活性,以及BACE1-AS下游的分子靶點(diǎn)及具體機(jī)制。
綜上所述,七氟烷可能通過下調(diào)BACE1-AS的表達(dá),抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移和糖酵解,同時(shí)促進(jìn)其凋亡,從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。