張維義 夏維 苑廣超 王芳 江輝 范李

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)約占原發(fā)性肝癌的75%～85%。吸入麻醉劑七氟烷被廣泛用于臨床的肝癌手術(shù)，但對肝細(xì)胞癌的作用尚無定論[1]。糖酵解在肝癌的惡性表型維持中起著關(guān)鍵作用。近年來，一種新型非編碼RNA BACE1-AS(BACE1 Antisense RNA)被認(rèn)為參與了多種腫瘤的進(jìn)展[2]。本研究通過觀察七氟烷對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移以及糖酵解的影響，同時(shí)觀察七氟烷對BACE1-AS表達(dá)的影響。

材料和方法

一、材料

肝癌細(xì)胞系(HepG2、Sk-Hep-1、SMMC-7721)和永生化人胎肝細(xì)胞系(L02/HL-7702)購自中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所。細(xì)胞在含有10%(v/v)熱滅活胎牛血清(FBS；Gibco，Gaithersburg，MD)的DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher Science Life Sciences，Waltham，MA)培養(yǎng)。細(xì)胞接種于37 ℃的組織培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱內(nèi)含5%CO2。用4%濃度的七氟烷(Sigma，St.Louis，MO)刺激細(xì)胞24小時(shí)。

二、方法

1.細(xì)胞增殖檢測：用CCK-8(Dojindo公司)檢測肝癌細(xì)胞細(xì)胞增殖率。將細(xì)胞播種到96孔板中，經(jīng)七氟烷刺激后，每孔加入CCK-8溶液，37 ℃、95%空氣和5%CO2的濕化氣氛中孵育1小時(shí)。用微板閱讀器(Bio-Rad，Hercules，CA)在450 nm處檢測吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.細(xì)胞凋亡檢測：細(xì)胞經(jīng)過七氟烷刺激后，用Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測試劑盒按照制造商的描述檢測細(xì)胞凋亡進(jìn)程。在50 μg/ml核糖核酸酶A(SIGMA)存在下，用Annexin V-FITC/碘化丙啶(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide)在黑暗中對細(xì)胞進(jìn)行染色。隨后，在FACScan流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA)上檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)：將1 000個(gè)細(xì)胞接種到六孔板中，并在含有10% FBS的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將乳腺癌細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30分鐘，用0.1%結(jié)晶紫染色30分鐘。手工計(jì)數(shù)可見克隆數(shù)。將懸浮細(xì)胞加入含有1%胎牛血清的上室，而下室含有10%胎牛血清。孵育后，將侵入下腔的細(xì)胞固定，顯微鏡下染色計(jì)數(shù)。上室加入基質(zhì)膠后，將100 μl含有1%胎牛血清的培養(yǎng)基懸浮的乳腺癌細(xì)胞加入上室，下室含有10%胎牛血清。孵育后，將侵入小室的細(xì)胞固定，顯微鏡下染色計(jì)數(shù)。

4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：待六孔板里的細(xì)胞鋪滿后，用槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，將細(xì)胞接種與中間區(qū)域然后培養(yǎng)，帶細(xì)胞長滿區(qū)域后用鑷子移除既可以觀察到劃痕。

5.生物信息學(xué)：利用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫對BACE1-AS的相關(guān)生物學(xué)信息進(jìn)行挖掘，包括肝癌組織中的表達(dá)量，預(yù)后相關(guān)分析等。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件(GraphPad Software，California)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較結(jié)果使用非配對雙尾t檢驗(yàn)或單方差分析，然后進(jìn)行Bonferroni后檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.七氟烷對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響：與未處理細(xì)胞比較，七氟烷刺激明顯降低HepG2細(xì)胞的存活率(P<0.05，圖1A)。此外，我們觀察到七氟烷是一種有效的促凋亡因子(P<0.05，圖1B)。以上結(jié)果表明，七氟烷可以抑制肝癌細(xì)胞的生長，同時(shí)具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的特性。

2.七氟烷對肝癌細(xì)胞侵襲遷移的影響：Transwell實(shí)驗(yàn)表明，與未處理細(xì)胞比較，七氟烷刺激明顯降低HepG2細(xì)胞的侵襲力(P<0.05，圖2A)。此外，劃痕實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過七氟烷處理，HepG2細(xì)胞的遷移能力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。以上結(jié)果表明，七氟烷可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

3.七氟烷對肝癌細(xì)胞糖酵解的影響：與未處理細(xì)胞比較，七氟烷刺激降低HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取以及乳酸生成(P<0.05，圖3A)。此外，經(jīng)過七氟烷處理，HepG2細(xì)胞的細(xì)胞外酸化(ECAR)明顯下降，而耗氧量(OCR)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3B)。以上結(jié)果表明，七氟烷可以抑制肝癌細(xì)胞的糖酵解。

4.七氟烷降低癌基因BACE1-AS的表達(dá)：研究表明，非編碼RNA BACE1-AS是多種腫瘤的癌基因。我們通過挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，BACE1-AS在肝癌組織中的表達(dá)均高于對照組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4A)。此外，高表達(dá)BACE1-AS的肝癌病人生存期明顯更短，風(fēng)險(xiǎn)比達(dá)1.75，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4B)。另外，BACE1-AS在3種肝癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常肝細(xì)胞(P<0.05，圖4C)，而經(jīng)過七氟烷處理后，肝癌細(xì)胞BACE1-AS的表達(dá)降低(P<0.05，圖4D)。結(jié)果表明，BACE1-AS是一個(gè)肝細(xì)胞癌癌基因，七氟烷可以抑制其表達(dá)。

A：七氟烷抑制肝癌細(xì)胞的增殖；B：七氟烷促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡

A：七氟烷抑制肝癌細(xì)胞的侵襲；B：七氟烷抑制肝癌細(xì)胞的遷移

討論

七氟烷是臨床上一種常用揮發(fā)性麻醉劑。有研究表明，七氟烷在許多人類癌癥中顯示出抗癌活性。如，七氟烷通過抑制絲裂原相關(guān)蛋白激酶途徑的激活來抑制肺癌細(xì)胞的侵襲[3]。研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡來抑制增殖[4]。同時(shí)七氟烷通過下調(diào)MMP9在體外降低結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲力[5]。此外，七氟烷通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1a)而抑制缺氧誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[6]。七氟烷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和MMP-2活性有抑制作用[7]。然而，很少有報(bào)道涉及七氟烷在肝癌中的作用。本研究結(jié)果表明，七氟烷明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，同時(shí)促進(jìn)其凋亡。

A：七氟烷降低HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取以及乳酸的生成；B：經(jīng)過七氟烷處理，HepG2細(xì)胞的細(xì)胞外酸化(ECAR)明顯下降，而耗氧量(OCR)明顯上升

A：BACE1-AS在肝癌組織中高表達(dá)；B：高表達(dá)BACE1-AS提示較差的預(yù)后；C：BACE1-AS在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系中高表達(dá)；D：七氟烷可以降低BACE1-AS的表達(dá)

目前最新觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤細(xì)胞即使在充足的氧氣條件下也傾向于將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，這種現(xiàn)象被稱為有氧糖酵解或Warburg效應(yīng)，其特征是葡萄糖攝取和乳酸生成增加，細(xì)胞外酸化率的增加，而耗氧量降低[8]。在肝癌的進(jìn)展過程中，有氧糖酵解可以促進(jìn)惡性表型，乳酸的產(chǎn)生為肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了酸性環(huán)境[9]；有氧糖酵解的增加也與索拉非尼耐藥有關(guān)[10]。因此，糖酵解是肝癌細(xì)胞一個(gè)顯著的特征，也是潛在的治療靶點(diǎn)。我們的研究結(jié)果表明，經(jīng)過七氟烷處理后，HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取以及乳酸的生成明顯下降，細(xì)胞外酸化明顯下降，而耗氧量明顯上升，提示七氟烷可以逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的有氧糖酵解。

長非編碼RNA(Long Non-Coding RNAs，LncRNAs)是一組長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，已被報(bào)道參與包括肝癌在內(nèi)的人類腫瘤相關(guān)。例如，lncRNA RHPN1-AS1(RHPN1 Antisense RNA 1)通過阻斷miR-596對IGF2BP2(Insulin Like Growth Factor 2 MRNA Binding Protein 2)表達(dá)的抑制來推動肝癌的進(jìn)展[11]。LncRNA SSTR5-AS1(SSTR5 Antisense RNA 1)參與了HBV相關(guān)肝癌的發(fā)展[12]。近年來，一種新型非編碼RNA BACE1-AS(BACE1 Antisense RNA)被認(rèn)為參與了多種腫瘤的進(jìn)展[13]。本研究結(jié)果表明，BACE1-AS是一個(gè)肝細(xì)胞癌相關(guān)癌基因，經(jīng)過七氟烷處理后，肝癌細(xì)胞BACE1-AS的表達(dá)明顯降低。

本研究總結(jié)了七氟烷在調(diào)節(jié)BACE1-AS通路中的新作用，并在體外發(fā)揮其抗腫瘤活性。然而，本研究還存在一定的局限性，還需要更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)BACE1-AS介導(dǎo)的七氟烷在肝癌中的抗腫瘤活性，以及BACE1-AS下游的分子靶點(diǎn)及具體機(jī)制。

綜上所述，七氟烷可能通過下調(diào)BACE1-AS的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移和糖酵解，同時(shí)促進(jìn)其凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。