王曉龍 陳亮 曹洪濤 林波 湯婷婷 馬克強 嵇騰飛 曹天生 王健 張文偉 楊建榮 盧卓才 由田 何青青 繆巍

胃癌是消化系統(tǒng)常見的消化系統(tǒng)腫瘤，是全球第3大腫瘤相關性死亡的原因[1]。幽門螺桿菌、飲食、遺傳因素等與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[2]。巨噬細胞、樹突狀細胞、單核細胞、中性粒細胞及其表達的細胞因子、趨化因子等在胃癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3]。Chemokine(C-C motif) ligand 22(CCL22)是巨噬細胞、樹突狀細胞等表達的一種趨化因子，可以識別并趨化表達CCR4的T-reg細胞、Th2細胞等，抑制機體針對病原體、腫瘤細胞的免疫反應，促進病原體持續(xù)感染、腫瘤發(fā)展[4-5]。胃癌組織中CCR4表達水平增高[6]。本研究收集胃癌病人外周血標本，檢測外周血中CCL22表達水平，并分析其表達水平與胃癌臨床分期的相關性，研究CCL22對胃癌細胞的趨化作用，探討CCL22在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

對象與方法

一、對象

2016年1月～2019年1月在青海大學附屬醫(yī)院和南方醫(yī)科大學附屬花都醫(yī)院胃腸外科住院的胃癌病人55例，男性40例，女性15例，年齡41～65歲，平均年齡50.3歲，經(jīng)病理學檢查確診。按胃癌最新分期標準分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期17例，Ⅲ期13例，Ⅳ期15例。術前檢查未發(fā)現(xiàn)主要臟器的器質性病變，未行放化療或生物治療。對照組30例，男性24例，女性6例，年齡38～58歲，平均年齡48.2歲，為健康體檢者。所有入組者無并發(fā)HIV、乙型或丙型病毒性肝炎，未使用免疫抑制劑，排除自身免疫性疾病。

二、方法

1.標本收集：于晨起采空腹肘靜脈血10 ml，5 ml裝入干燥無菌非抗凝真空管，室溫靜置60分鐘后自行凝固，再以1 500 r/min離心12分鐘，取上清用EP管分裝，放入超低溫冰箱保存。5 ml放入無菌含肝素的抗凝管，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離、純化外周血單個核細胞。

2.總RNA提取及定量PCR：細胞總RNA提取采用用Trizol試劑盒(Invitrogen公司)。細胞總RNA反轉錄為cDNA采用反轉錄試劑盒(Toyobo公司,Japan)。然后用real-time PCR Faststart Universal SYBR Green Master(Rox)試劑(Roche公司)擴增。擴增CCL22的引物如下[7]：F:5＇-ATTACGTCCGTTACCGTCTGC-3＇，R:5＇-TCCCTGAAGGTTAGCAACACC-3＇。

3.ELISA ：血清中CCL22蛋白表達水平用美國R&D公司ELISA試劑盒(貨號：DMD00)檢測，具體步驟按說明書操作。

4.趨化實驗：用Biocoat細胞培養(yǎng)小室(Biocoat Invasion Chamber，BD公司)檢測CCL22對胃癌細胞株SNU216的趨化作用。將5×105個胃癌細胞置入chamber上層，加入或不加入不同濃度的CCR4抗體(Santa Cruz公司)，用無血清dulbecco's modified eagle medium(DMEM)培養(yǎng)液培養(yǎng)，將CCL22蛋白加入chamber下層，將chamber放入培養(yǎng)箱孵育，6～24小時后Giemsa染色，光鏡下計數(shù)，檢測CCL22對胃癌細胞遷移的作用。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)。組間均數(shù)比較采用t檢驗或方差分析。相關性分析采用Pearson's相關性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1.外周血中CCL22 RNA表達見圖1。結果顯示，胃癌組CCL22mRNA表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 兩組病人外周血中CCL22 mRNA表達水平

2.外周血中CCL22蛋白質表達見圖2。結果顯示，胃癌組CCL22蛋白表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05) 。

圖2 兩組病人外周血中CCL22蛋白質表達水平

3.外周血中CCL22表達水平見表1。結果顯示，胃癌組病人外周血CCL22表達水平隨胃癌分期而逐漸增高。

表1 不同胃癌分期病人外周血CCL22表達(pg/ml)

4.CCL22可趨化胃癌細胞：如圖3所示，CCL22呈劑量依賴性誘導胃癌細胞株SNU216遷移(圖3A)。加入CCR4抗體阻斷CCL22誘導的SNU216細胞遷移(圖3B)。

圖3 A:CCL22誘導胃癌細胞遷移;B:CCR4抗體阻斷CCL22誘導的胃癌細胞遷移

討論

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌病人外周血中趨化因子CCL22表達增高，且其表達水平隨胃癌分期而逐漸增高，CCL22呈劑量依賴性誘導胃癌細胞遷移。CCL22是一種趨化因子，可以趨化Treg細胞、Th2細胞、單核細胞等，抑制機體針對腫瘤細胞的免疫反應，促進腫瘤發(fā)展[4-5]。

有研究證實，胃癌組織中Treg細胞數(shù)量增多，且Treg細胞表面CCR4表達增高[8]，而CCR4是CCL22識別并結合的受體。CCL22識別并結合表達CCR4的免疫細胞，發(fā)揮趨化作用。CCL22通過與CCR4識別、結合，趨化Treg細胞等免疫細胞聚集至胃癌組織，改變腫瘤浸潤淋巴細胞的組成，在腫瘤局部發(fā)揮免疫抑制作用，有利于腫瘤的生長。因此，本研究推測針對CCL22的表達可能作為治療胃癌的一個靶點。

有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中趨化因子CCL20、CCL17表達增高[1，9]，CCL20通過識別結合表達CCR6、CCL17通過識別結合表達CCR4的免疫細胞浸潤至胃癌組織，參與胃癌的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌病人外周血中CCL22表達增高，且其表達水平與胃癌分期呈正相關，而CCL22亦可識別并結合CCR4，發(fā)揮趨化作用。研究報道胃癌細胞表達CCR4[10]。我們利用細胞模型進行趨化實驗，研究發(fā)現(xiàn)，CCL22呈劑量依賴性誘導胃癌細胞遷移，CCR4抗體可阻斷CCL22誘導的胃癌細胞遷移。因此，CCL22可能通過識別結合表達CCR4的免疫細胞參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，亦可能通過識別結合表達CCR4的胃癌細胞促進胃癌轉移。

綜上所述，胃癌病人外周血中CCL22表達增高，其表達水平隨胃癌分期而逐漸增高，CCL22可趨化胃癌細胞遷移，CCL22可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移。