杜金梁，曹麗萍，賈 睿，顧鄭琰，何 勤，徐 跑，，JENEY Galina，馬玉忠，殷國俊，，*

(1.中國水產科學研究院 淡水漁業(yè)研究中心/農業(yè)農村部淡水漁業(yè)和種質資源利用重點實驗室，江蘇 無錫 214081； 2.中國水產科學研究院 淡水漁業(yè)研究中心/魚類免疫藥理學國際聯(lián)合實驗室，江蘇 無錫 214081； 3.河北農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河北 保定 071001； 4.南京農業(yè)大學 無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214081； 5.匈牙利水產與漁業(yè)研究所 國家農業(yè)研究中心，匈牙利 索爾沃什 5440)

脂肪肝損傷在羅非魚(Oreochromisniloticus)養(yǎng)殖過程中頻繁發(fā)生，是一種常見多發(fā)性疾病。羅非魚患此病后機體通常會表現(xiàn)為免疫力下降、增重緩慢、肉質差、抗應激能力降低，若此病發(fā)生在夏季，患病羅非魚更容易受到細菌病、病毒病的侵襲，造成魚類大面積死亡，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴重阻礙羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。研究表明，魚類脂肪肝損傷主要受以下幾種因素影響：飼料配方配比不合理、養(yǎng)殖密度過大、養(yǎng)殖環(huán)境差等[1-3]。關于魚類脂肪肝的發(fā)病機理，有學者認為是由于肝內脂肪合成和代謝發(fā)生紊亂，使得肝內脂質合成和脂質氧化之間失衡所致[4-5]。也有學者認為氧化應激反應是造成脂肪肝損傷的誘因[6-7]，到目前為止，關于魚類脂肪肝具體發(fā)病機制依然沒有定論。養(yǎng)殖過程中多采用在飼料中添加抗脂肪因子、肉堿等西藥防治魚類脂肪肝損傷，雖然取得了一定療效，但治療效果并不理想，且過多使用容易造成魚體內藥物殘留，導致養(yǎng)殖環(huán)境污染，進而影響人類健康。因此，急需研發(fā)綠色無殘留的抗脂肪肝藥物。目前，關于抗魚類脂肪肝損傷藥物篩選的報道還較少，學者們主要圍繞草魚和斑馬魚開展了少量研究，如飼料中添加L-肉毒堿、膽汁酸等可以有效降低草魚的體脂含量和肝脂含量[8-9]；制首烏醇提取物對斑馬魚非酒精性脂肪肝具有較好的治療效果[10]；垂盆草提取物對于草魚脂肪性肝損傷具有良好治療作用[11]。當前大部分治療脂肪肝藥物篩選研究主要集中在哺乳動物，二苯乙烯苷、大麻二酚、歐芹根總黃酮等藥物對大鼠非酒精性脂肪肝損傷具有較好的治療作用[12-14]，治療羅非魚脂肪肝損傷藥物的篩選還鮮有報道。

隨著人類生活水平的不斷提高，魚作為餐桌上的必備食材，其安全性越來越受到重視，綠色健康養(yǎng)殖就顯得尤為重要。中草藥具有綠色無公害、無毒副作用、無藥物殘留等優(yōu)點，被廣泛用于治療疾病，具有很好的應用前景。甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)是臨床上應用較廣的一種中草藥，其具有抗炎殺菌、保肝護肝等功效。甘草總黃酮(Glycyrrhizatotal flavones)是甘草提取物有效成分之一，關于甘草總黃酮治療哺乳動物脂肪肝的報道較多。甘草總黃酮對SD大鼠非酒精性脂肪肝具有干預作用[15]；甘草黃酮提取物能夠調節(jié)大鼠血糖血脂[16]；甘草黃酮分散片可以修復四氯化碳造成的小鼠肝損傷[17]。目前甘草總黃酮對羅非魚脂肪肝損傷是否有治療作用未見報道。本研究以羅非魚作為實驗對象，用高脂飼料構建羅非魚脂肪肝損傷模型，探索甘草總黃酮對高脂條件誘導下羅非魚肝損傷是否具有保護作用，為開發(fā)羅非魚綠色保肝藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚購于中國水產科學院淡水漁業(yè)研究中心屺亭漁場，體表完好、游姿正常，體重為(30±1)g。實驗開始前放置于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1周，水溫設定為(30±1)℃，每天上午和下午各投喂1次飼料。

甘草總黃酮購于上海源葉生物科技有限公司(貨號：S25400)；甘油三酯(triglyceride， TG)、總膽固醇(total cholesterol， TC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde， MDA)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity， T-AOC)試劑盒購自南京建成海浩生物工程有限公司；蛋白水平測定所需試劑購于上海碧云天生物技術有限公司；熒光定量PCR所需試劑購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 飼料組方與試驗分組

選取180尾健康、無傷，體重為(30±1) g的羅非魚，隨機分為6組，每組30尾魚，分別為空白對照組、高脂飼料模型組和4個不同濃度(0.05、0.10、0.50、1.00 g·kg-1)甘草總黃酮藥物處理組。每組設定3個重復，每個重復10尾魚。每日飼喂2次，按體重的4%來確定飼喂量，連續(xù)飼喂90 d。空白對照組：僅飼喂基礎飼料(粗脂肪含量為6%)；高脂組：投喂高脂飼料(粗脂肪含量為21%)；甘草總黃酮藥物處理組：分別在高脂飼料中添加0.05、0.10、0.50、1.00 g·kg-1甘草總黃酮。各實驗組日糧情況參照實驗室飼料配方改良而成[18]，如表1所示。

表1 實驗組日糧組成

1.2.2 樣本采集與處理

連續(xù)飼喂90 d后，采集羅非魚肝進行肝勻漿液制備，并提取肝蛋白質。肝勻漿液制備：將羅非魚肝用0.9% NaCl溶液漂洗，然后用勻漿器制成10%的肝勻漿液，3 500g離心10 min后，取上清液于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。肝蛋白質提?。簩⒏斡眉舻都羲?，加入細胞裂解液提取蛋白質，以每20 mg肝加入150 μL裂解液為準，充分裂解后，放入離心機10 000～14 000g離心3～5 min，取上清進行后續(xù)試驗操作。蛋白質濃度的測定參照蛋白質定量測定試劑盒說明書。

1.2.3 生化指標測定

取肝勻漿上清液按照說明書測定SOD活性、GSH活性、MDA含量、TG含量、TC含量、T-AOC水平。

1.2.4 核轉錄因子-κB C-Rel和κB P 65蛋白表達水平檢測

Western blot參照張燕婉等[19]的方法，肝蛋白樣品經(jīng)過變性、SDS-PAGE電泳、半干轉膜儀轉膜、封閉液封閉、一抗孵育、二抗孵育、化學發(fā)光顯色等步驟后，檢測羅非魚肝中核轉錄因子-κB C-Rel和κB P 65蛋白表達情況。

1.2.5 熒光定量PCR

采用Trizol法提取羅非魚肝中總RNA，具體提取步驟參照Takara RNA提取試劑盒說明書進行。用全自動酶標儀測定總RNAD260/D280值，然后按照Takara反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應。制備好的cDNA樣本將用于熒光定量PCR試驗。熒光定量PCR所采用試劑來自寶生物工程(大連)有限公司，MTTP、ApoB100基因相對表達量采用2-ΔΔCt法[20]計算。qRT-PCR所用引物見表2。

表2 qRT-PCR引物信息

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件包中單因素ANOVA方法進行統(tǒng)計分析，結果用平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 甘草總黃酮對高脂條件下羅非魚肝中TC、TG含量的影響

如圖1所示，投喂高脂飼料90 d，羅非魚肝中TC、TG含量與對照組相比極顯著升高(P<0.01)。與高脂組相比，投喂含有不同濃度的甘草總黃酮飼料后，羅非魚肝中TC、TG含量不同程度降低，1.00 g·kg-1甘草總黃酮組羅非魚肝中TC含量顯著降低(P<0.05)，0.50 g·kg-1甘草總黃酮組羅非魚肝中TG含量極顯著降低(P<0.01)。說明甘草總黃酮對于高脂飼料造成的羅非魚肝脂肪沉積有一定的緩解作用。

2.2 甘草總黃酮對高脂條件下羅非魚肝中GSH活性的影響

如圖2所示，投喂高脂飼料后，與對照組相比，羅非魚肝中GSH活性極顯著降低(P<0.01)；投喂含不同濃度的甘草總黃酮飼料后，0.50 g·kg-1甘草總黃酮組保肝效果較好，肝中GSH活性顯著(P<0.05)高于高脂組，其他藥物組GSH活性與高脂組相比無顯著差異(P>0.05)。表明甘草總黃酮對高脂飼料造成的羅非魚肝抗氧化系統(tǒng)損傷具有一定的保護作用。

2.3 甘草總黃酮對高脂條件下羅非魚肝中SOD活性的影響

如圖3所示，投喂高脂飼料后，與對照組相比，羅非魚肝中SOD活性極顯著(P<0.01)降低；飼料中加入不同濃度甘草總黃酮后，與高脂組相比，0.50 g·kg-1甘草總黃酮組羅非魚肝中SOD活性顯著升高(P<0.05)，這表明甘草總黃酮對高脂飼料造成的羅非魚肝氧化損傷具有一定的保護作用。

2.4 甘草總黃酮對高脂條件下羅非魚肝中T-AOC水平的影響

如圖4所示，投喂高脂飼料后，羅非魚肝中T-AOC水平較對照組極顯著下降(P<0.01)；投喂含有不同濃度的甘草總黃酮飼料后，與高脂組相比，0.05 g·kg-1、0.10 g·kg-1和0.50 g·kg-1甘草總黃酮組羅非魚肝中T-AOC水平均顯著升高(P<0.01或P<0.05)，以0.10 g·kg-1甘草總黃酮組升高幅度最大。這表明甘草總黃酮可以提高羅非魚肝的抗氧化能力，抑制高脂飼料造成的羅非魚肝損傷。

2.5 甘草總黃酮對高脂條件下羅非魚肝中MDA含量的影響

如圖5所示，與對照組相比，投喂高脂飼料組羅非魚肝中MDA含量極顯著升高(P<0.01)；投喂含不同濃度的甘草總黃酮飼料后，羅非魚肝中MDA含量與高脂組無顯著差異(P>0.05)。

2.6 甘草總黃酮對NF-κB C-Rel、NF-κB P65 蛋白表達的影響

如圖6所示，與對照組相比，高脂飼料組羅非魚肝中NF-κB P65蛋白和C-Rel蛋白表達水平極顯著(P<0.01)增加，這說明高脂飼料誘導了NF-κB相關蛋白的表達；飼料中加入不同濃度甘草總黃酮進行干預后，肝中NF-κB C-rel和NF-κB P 65蛋白表達水平不同程度降低，與高脂組相比，0.50 g·kg-1甘草總黃酮組降低顯著(P<0.05)，說明甘草總黃酮可以促進肝中脂蛋白的代謝，減輕肝損傷。

2.7 甘草總黃酮對MTTP、ApoB100基因表達的影響

如圖7-A所示，高脂飼料組羅非魚肝中MTTPmRNA表達水平顯著(P<0.05)低于對照組，飼料中加入甘草總黃酮干預后，0.10 g·kg-1、0.50 g·kg-1和1.00 g·kg-1甘草總黃酮組羅非魚肝中MTTPmRNA表達水平極顯著(P<0.01)高于高脂組。由圖7-B可知，高脂組羅非魚肝中ApoB100 mRNA表達水平極顯著(P<0.01)低于對照組，飼料中加入甘草總黃酮干預后，0.50 g·kg-1和1.00 g·kg-1甘草總黃酮組羅非魚肝中ApoB100 mRNA表達水平極顯著(P<0.01)高于高脂組。綜上，推測甘草總黃酮可以促進脂肪在肝中轉運和代謝，減輕脂肪蓄積造成的肝損傷。

3 討論

目前，魚類脂肪肝發(fā)病機理研究眾多，但是造成魚類肝損傷的具體發(fā)病機制尚不清晰，且不同品種魚類發(fā)病機制可能存在差異；因此，深入研究魚類肝損傷的發(fā)病機理和藥物篩選工作，對于防治魚類脂肪肝損傷疾病具有重要意義。本研究主要從生化指標、分子生物學指標來探討高脂飼料對羅非魚造成肝損傷的情況，并評價飼料中添加甘草總黃酮是否對高脂飲食造成的羅非魚肝損傷具有保護作用。

3.1 甘草總黃酮對羅非魚肝中TG、TC含量的影響

甘油三脂和總膽固醇是臨床上診斷脂肪肝疾病的常用指標，脂肪肝患者血清中TG、TC含量通常會出現(xiàn)升高現(xiàn)象[21-23]。近些年來，隨著研究人員對魚類脂肪肝損傷研究的不斷深入，TG、TC這2個經(jīng)典指標被科技工作者們廣泛應用到水產動物中。有研究指出，患有脂肪肝損傷魚類的血清或者肝中血脂水平也呈升高趨勢[24-28]。本實驗結果與前人研究結果類似，羅非魚飼喂高脂飼料90 d后，肝勻漿中TG、TC含量極顯著升高，這表明在高脂飼料的誘導下，羅非魚肝中脂肪代謝出現(xiàn)障礙，造成脂肪在肝中蓄積。而飼料中加入甘草總黃酮藥物進行干預后，可以不同程度降低肝中TG、TC的含量，這表明甘草總黃酮對于促進脂肪代謝，減少脂肪在羅非魚肝中沉積具有一定的效果。已經(jīng)有學者在小鼠上得出了類似結果。王晶等[29]、劉國棟[30]研究表明，甘草總黃酮對小鼠高脂血癥有較好的干預作用，這說明甘草總黃酮不僅可以促進哺乳動物機體脂質代謝，對水產動物也具有較好的治療效果。

3.2 甘草總黃酮對羅非魚肝中抗氧化指標的影響

抗氧化酶系統(tǒng)在維護機體健康方面發(fā)揮著重要作用，外界病原或者微生物侵害機體時，體內的抗氧化酶系統(tǒng)就會被激活，保護機體免受致病因素損害[31]。SOD、GSH、T-AOC是評判機體抗氧化能力的常用生化指標[32-33]。MDA是生物體脂質過氧化產物，脂質過氧化反應也是判定機體健康與否的重要因素，在致病因素的作用下，機體中MDA含量會不斷升高，導致細胞膜受損傷，細胞出現(xiàn)代謝功能障礙，繼而引發(fā)一系列病理反應[34]。有報道證實，魚類肝損傷疾病的發(fā)生與氧化應激反應密切相關。Cao等[35]研究發(fā)現(xiàn)，甘草提取物對叔丁基氫過氧化物(t-BHP)可以導致建鯉肝產生大量自由基，造成肝細胞損傷。杜金梁等[36]研究發(fā)現(xiàn)，甘草提取物抗環(huán)境致毒物二噁英造成的魚肝損傷也與氧化應激存在關聯(lián)。在本研究中，投喂高脂飼料90 d后，羅非魚肝勻漿中GSH活性、SOD活性、T-AOC水平均降低，MDA含量升高，表明高脂飼料誘導羅非魚肝發(fā)生了氧化應激反應，使羅非魚機體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)失衡，導致羅非魚肝受損傷，肝中各生化指標隨之發(fā)生變化。當飼料中加入不同濃度甘草總黃酮后，各藥物實驗組羅非魚肝GSH活性、SOD活性和T-AOC水平均不同程度升高，MDA含量降低。這說明甘草總黃酮可以幫助機體抵抗氧化應激造成的損害，減少自由基的產生，維持機體平衡狀態(tài)。

3.3 甘草總黃酮對羅非魚肝中核轉錄因子蛋白水平的影響

NF-κB作為核轉錄因子，其家族成員眾多，NF-κB P65和C-Rel是學者們研究比較多的2個家庭成員。已經(jīng)有大量文獻報道NF-κB信號通路與肝疾病的發(fā)生發(fā)展存在關聯(lián)[37-38]，肝受損傷后核轉錄因子會被激活。如郭威等[39]發(fā)現(xiàn)，L-谷氨酰胺可以抑制小鼠肝中NF-κB P65蛋白的表達；劉英娟等[40]發(fā)現(xiàn)，低濃度的槲皮素可抑制NF-κB P65和C-Rel蛋白表達。本研究結果與劉英娟等[40]的報道類似，高脂飼料顯著誘導了羅非魚肝中NF-κB P65蛋白和C-Rel蛋白表達，表明高脂飼料引起肝受損后激活了羅非魚肝中核轉錄因子，造成肝內蛋白的分泌和合成出現(xiàn)異常。飼料中在加入甘草總黃酮后，NF-κB p65蛋白和C-Rel蛋白表達不同程度降低，這說明甘草總黃酮對高脂飼料造成的羅非魚肝核轉錄因子蛋白表達具有一定抑制作用，能促進脂蛋白在肝內轉運和代謝，可以減輕肝損傷。

3.4 甘草總黃酮對羅非魚肝中極低密度脂蛋白組裝相關基因表達的影響

MTTP和ApoB100基因同屬于卵黃蛋白原家族成員，是肝中脂蛋白分泌和代謝所必需的重要轉移蛋白，它們在維持肝正常生理功能方面發(fā)揮著重要作用[41]。MTTP基因主要通過與載脂蛋白B共同作用來實現(xiàn)肝中脂質蛋白的轉運。研究發(fā)現(xiàn)，當肝中MTTP基因表達水平降低時，載脂蛋白B的合成量也會隨著降低，肝脂質代謝會出現(xiàn)紊亂，引發(fā)脂肪肝疾病的發(fā)生[42-43]。本研究也出現(xiàn)類似結果，高脂飼料投喂羅非魚后，MTTP和ApoB100 mRNA表達水平均降低，這說明高脂飲食造成羅非魚肝中脂類合成和代謝出現(xiàn)障礙，肝中脂類物質不能及時轉運，造成脂類物質在肝中不斷蓄積。在高脂飼料中加入甘草總黃酮干預后，MTTP和ApoB100 mRNA表達水平升高，這表明甘草總黃酮可以促進脂類物質在羅非魚肝中轉運，緩解脂類物質在肝中不斷蓄積所造成的損害。

綜上，長時間投喂高脂飼料可以造成羅非魚肝氧化應激損傷，而飼料中添加0.50 g·kg-1甘草總黃酮對高脂飲食造成的肝損傷有一定的緩解作用，可以促進脂類物質的快速代謝，避免脂類物質的持續(xù)聚集所造成的損害，減輕肝炎癥反應，增強羅非魚機體的抗氧化能力。本研究結果對后期開發(fā)治療羅非魚脂肪肝藥物具有一定的指導意義，甘草總黃酮具體藥理作用還需進一步研究。