王興寧，王 濤，李 潔，李 志，唐亞峰，梁藝馨，朱 明

（1. 貴陽海關(guān)綜合技術(shù)中心，貴州 貴陽 550081；2. 貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽 540003）

氟吡禾靈屬于苯氧羧酸類除草劑，主要以氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈2 種形式生產(chǎn)。兩者均為出苗前和出苗后選擇性除草劑，用于控制闊葉作物中的禾本科雜草，其機(jī)理是抑制乙酰輔酶A 羧化酶（ACCase），導(dǎo)致脂肪酸合成受阻［1－2］。該化合物的分子結(jié)構(gòu)含有酯和羧基，其酯類在土壤或植物中迅速降解為其母體酸，并通過酯鍵、糖苷鍵或其他鍵與基質(zhì)組分共價結(jié)合，在作物中形成二級共軛殘基［3－4］。苯氧羧酸類除草劑及其代謝降解產(chǎn)物對哺乳動物、魚類、鳥類和人類毒性很低，但攝入一定量的該類除草劑可引起腹瀉、食欲減退、抑郁，出現(xiàn)肺、肝臟、脾臟和腦膜的嚴(yán)重充血等毒性反應(yīng)。因此，歐盟、日本和美國等國家和地區(qū)均對其在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留規(guī)定了嚴(yán)格限量。

GB 2763－2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了氟吡甲禾靈、氟吡禾靈及其共軛物之和，以氟吡甲禾靈表示，在葵花籽、結(jié)球甘藍(lán)及柑橘等植物源性食品中的最大殘留限量為0.02～3 mg/kg［5］。歐盟農(nóng)藥殘留法規(guī)（EU）No.396/2005 修訂了植物源性食品中氟吡禾靈（總氟吡禾靈，氟吡禾靈及其酯、鹽和共軛物的總和，以氟吡禾靈表示）的最大殘留限量為0.01～0.5 mg/kg［6］。日本肯定列表規(guī)定氟吡禾靈在豌豆、洋蔥及柑橘等植物源性食品中的最大殘留限量為0.01～0.5 mg/kg［7］。然而，當(dāng)前國內(nèi)外對植物源性食品中總氟吡禾靈的測定方法標(biāo)準(zhǔn)甚少。文獻(xiàn)報道氟吡禾靈的檢測方法主要有氣相色譜法［8－9］、氣相色譜－質(zhì)譜法［10］、液相色譜法［11］和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［12－18］等。運(yùn)用氣相色譜法和氣相色譜－質(zhì)譜法時，需對目標(biāo)物進(jìn)行衍生化，存在衍生副產(chǎn)物干擾嚴(yán)重、回收率低等缺點(diǎn)；液相色譜法的靈敏度高，但在檢測復(fù)雜基質(zhì)（如茶葉樣品）時確證困難；液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法是檢測氟吡禾靈的最佳技術(shù)手段，但目前的研究以檢測單一目標(biāo)物的氟吡禾靈和氟吡甲禾靈殘留為主，對總氟吡禾靈殘留缺少較為全面系統(tǒng)的研究，同時亦未對大米、檸檬、柑橘、馬鈴薯、茶葉等9 種植物源性食品基質(zhì)進(jìn)行考察。本文采用基質(zhì)分散固相萃取進(jìn)行樣品前處理，結(jié)合液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜建立了植物源性食品中總氟吡禾靈殘留的測定方法。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了各種基質(zhì)樣品的最佳水解條件，以評估氟吡禾靈酯和共軛物的轉(zhuǎn)化效率，同時優(yōu)化了基質(zhì)分散固相萃取條件，以適應(yīng)各種基質(zhì)類型樣品的凈化。該方法可為總氟吡禾靈殘留日常監(jiān)控提供實(shí)用的技術(shù)手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Sciex API 5500 Q型超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子源和Analyst1.5.1工作站（美國AB公司），高速分散機(jī)（i國IKA公司），Sigma 3K15離心機(jī)（美國Sigma公司）。

乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸（色譜純，上海安譜有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Elix/Milli-Q 高純水（美國Millipore 公司）；氫氧化鈉、硫酸（優(yōu)級純，上海國藥集團(tuán)）；無水硫酸鎂、乙酸鈉（農(nóng)殘級，阿拉丁試劑公司）；N-丙基乙二胺（PSA，40～60 μm）、石墨化炭黑（GCB，30～90 μm）、十八烷基硅烷（C18，50 μm，60 ?）（農(nóng)殘級，上海安譜有限公司）。

氟吡禾靈（CAS 號69806－34－4）、氟吡甲禾靈（CAS 號69806－40－2）和氟吡乙禾靈（CAS 號87237－48－7）（北京壇墨質(zhì)量檢測技術(shù)有限公司）；同位素內(nèi)標(biāo)（±）氟吡禾靈-D4（純度99.0%，加拿大Toronto Research Chemical公司）。

以乙腈為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的氟吡禾靈、氟吡甲禾靈、氟吡乙禾靈和氟吡禾靈-D4（內(nèi)標(biāo)）的單個標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，并于－20 ℃下儲存。以乙腈為溶劑，配制含有氟吡禾靈、氟吡甲禾靈及氟吡乙禾靈2.5、5.0、10、25、50 ng/mL（含內(nèi)標(biāo)50 ng/mL）的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

植物源性食品（檸檬、柑橘、馬鈴薯、結(jié)球甘藍(lán)、甜椒、洋蔥、大米、葵花籽及茶葉）的樣品購自貴陽當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件 ACQUITYUPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters 公司）；柱溫為40 ℃；樣品室溫度為15 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈；流速為0.2 mL/min。梯度洗脫程序如下：0～0.20 min，10% B；0.20～3.00 min，10%～50% B；3.00～7.00 min，50%～75%B；7.00～7.01 min，75%～10%B；7.01～10.0 min，10%B。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；正離子掃描；離子化電壓為－4 500 V；離子源溫度為400 ℃；氣簾氣壓力為1.38×105Pa；離子源噴霧氣壓力為2.07×105Pa；碰撞氣壓力為4.14×104Pa。MRM模式下的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM模式下的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters in MRM mode

1.3 樣品提取與凈化

1.3.1 高水分含量樣品的提取 準(zhǔn)確稱取5 g 樣品（精確至0.01 g）置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入50 μL 內(nèi)標(biāo)（10 μg/mL）渦旋混勻，再加入10 mL 乙腈和2 mL 5 mol/L NaOH 渦旋混勻，40 ℃水浴超聲水解和提取30 min，加入2 mL 2.5 mol/L H2SO4渦旋混合，酸化后的樣品提取液pH 值為5～7，加入6 g無水MgSO4和1.5 g乙酸鈉劇烈振搖30 s，以5 000 r/min離心5 min，收集上清液。

1.3.2 低水分含量樣品的提取 準(zhǔn)確稱取5 g 樣品（精確至0.01 g）置于50 mL 聚丙烯離心管中，茶葉樣品稱取2 g（精確至0.01 g），加入50 μL 內(nèi)標(biāo)（10 μg/mL）渦旋混勻，加入10 mL 水渦旋混合后靜置30 min，再加入10 mL 乙腈和2 mL 5 mol/L NaOH渦旋混勻，后續(xù)操作同“1.3.1”。

1.3.3 凈 化 在2 mL微型離心管中預(yù)裝150 mg無水MgSO4、50 mg C18和50 mg GCB，吸取提取的乙腈相至離心管中，渦旋振蕩5 min 后6 000 r/min 離心1 min，上清液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾于2 mL 進(jìn)樣小瓶，待測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

比較了ESI－和ESI+兩種模式下氟吡禾靈、氟吡禾靈-D4、氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈的信號強(qiáng)度。以含5 mmol/L 乙酸銨的甲醇－水（1∶1，體積比）配制100 ng/mL 上述4種化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并以10 mL/min的流速直接注入質(zhì)譜。結(jié)果表明，氟吡禾靈和氟吡禾靈-D4在ESI－和ESI+兩種模式下均有較高的信號強(qiáng)度，而氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈僅在ESI+模式下具有較高的信號強(qiáng)度。因此，采用ESI+模式可實(shí)現(xiàn)所有目標(biāo)物的同時監(jiān)測，并進(jìn)一步優(yōu)化ESI+模式下MRM 的母離子、子離子、碰撞能量和去簇電壓，每個目標(biāo)物選擇豐度較高、干擾最少的2組離子對用于MRM監(jiān)測。最終優(yōu)化的質(zhì)譜條件如“1.2.2”所示。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

氟吡禾靈和氟吡禾靈酯屬于中等極性和弱極性化合物，在弱極性的C18柱上均具有較好的保留。實(shí)驗(yàn)比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Agilent ZORBAX SB－C18（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）的分離效果，結(jié)果表明，兩柱均能較好地分離氟吡禾靈、氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈，前者的分離效果更優(yōu)，因此選擇ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。實(shí)驗(yàn)分別以甲醇－水和乙腈－水為流動相進(jìn)行分離，均不能得到良好的峰形，考慮到流動相添加劑（如乙酸銨和甲酸）可顯著改善色譜峰的分離度與靈敏度，進(jìn)一步比較了甲醇－5 mmol/L 乙酸銨水溶液和0.1%甲酸乙腈－0.1%甲酸水溶液的分離效果。結(jié)果表明，以0.1%甲酸乙腈－0.1%甲酸水溶液為流動相可獲得最佳的分離度和靈敏度。在“1.2”的最佳條件下，目標(biāo)物的總離子流色譜圖見圖1。由圖可知，目標(biāo)物的響應(yīng)強(qiáng)度高、無干擾，分離度高、峰形良好。

圖1 10 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Chromatogram for mixed standard solution at concentration of 10 ng/mL haloxyfop-D4：50 ng/mL

2.3 提取條件的優(yōu)化

考察了不同提取方法對復(fù)雜基質(zhì)茶葉樣品的去除雜質(zhì)效果以及提取和水解效果。通過向茶葉樣品中添加氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈的標(biāo)準(zhǔn)溶液評估總氟吡禾靈的轉(zhuǎn)化率。比較了以下4種常用的水解和萃取條件：①室溫渦旋30 min；②室溫渦旋30 min，40 ℃水浴恒溫30 min；③40 ℃恒溫振蕩30 min；④40 ℃超聲水解30 min。每個實(shí)驗(yàn)均加入1 mL 5 mol/L NaOH進(jìn)行水解和1.5 mL 2.5 mol/L H2SO4進(jìn)行中和［14］。結(jié)果表明，采用方法④獲得的總氟吡禾靈轉(zhuǎn)化率最高，因此選擇樣品提取條件為40 ℃超聲水解30 min。

2.4 水解條件的選擇

氟吡禾靈酯類主要有氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈，在施用農(nóng)作物后的短時間內(nèi)，所有酯類均降解為氟吡禾靈［4］。當(dāng)前采用堿性水解等方式將氟吡禾靈酯類、鹽及共軛物直接轉(zhuǎn)化為氟吡禾靈，測定氟吡禾靈總和，與歐盟農(nóng)殘限量規(guī)定表示一致，并以氟吡禾靈酯類的轉(zhuǎn)化情況作為評價標(biāo)準(zhǔn)［13］。堿性條件有助于提高氟吡禾靈的轉(zhuǎn)化率，但過量的堿可能導(dǎo)致目標(biāo)物分解和隨后的中和困難。選擇檸檬樣品（酸性樣品消耗最多的堿）添加0.01 mg/kg 的氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察了5 mol/L NaOH 用量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL）對總氟吡禾靈轉(zhuǎn)化率的影響（圖2）。結(jié)果表明，5 mol/L NaOH 用量為2.0 mL和2.5 mL時總氟吡禾靈的轉(zhuǎn)化率較高并趨于平穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)最終確定5 mol/L NaOH 用量為2 mL，可適用于大多數(shù)類型樣品基質(zhì)的水解。

圖2 不同體積堿用量對檸檬樣品中總氟吡禾靈的水解效果Fig.2 Hydrolysis efficiency for total haloxyfop with different volume alkali in lemon sample spiked at 0.01 mg/kg haloxyfop-p-methyl and haloxyfop-2-etotyl

2.5 凈化方法的優(yōu)化

基質(zhì)分散固相萃取具有快速、操作簡單、吸附能力強(qiáng)等特點(diǎn)，被廣泛用于食品中農(nóng)藥殘留檢測［19］。按照優(yōu)化的提取方法對添加0.01 mg/kg 氟吡禾靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的茶葉樣品進(jìn)行處理，提取液轉(zhuǎn)入2 mL 預(yù)裝有4 種不同比例吸附劑（MgSO4、C18、PSA和GCB）的微型離心管中進(jìn)行凈化（圖3）。不同吸附劑的組合如下：①M(fèi)gSO4150 mg 和C1825 mg；②MgSO4150 mg 和C1850 mg；③MgSO4150 mg和C18100 mg；④MgSO4150 mg、C1825 mg 和PSA 25 mg；⑤MgSO4150 mg、C1825 mg 和GCB 25 mg；⑥MgSO4150 mg、C1825 mg、PSA 25 mg 和GCB 25 mg。結(jié)果表明，組合①、②、③和⑤均可獲得滿意的回收率，而由于PSA 對目標(biāo)物具有吸附作用，導(dǎo)致組合④和⑥的回收率下降?？紤]植物源性食品基質(zhì)的復(fù)雜性，最終確定適用于廣泛基質(zhì)范圍的吸附劑組合MgSO4150 mg、C1850 mg和GCB 50 mg。

圖3 不同吸附劑組合對茶葉樣品（添加0.01 mg/kg氟吡禾靈）的回收率Fig.3 Recovery of tea samples clean-up with different sorbents（spiked at 0.01 mg/kg haloxyfop）

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

植物源性食品中色素、有機(jī)酸和脂肪等雜質(zhì)易引起基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，研究表明基質(zhì)種類、基質(zhì)數(shù)量和目標(biāo)物化學(xué)性質(zhì)對基質(zhì)效應(yīng)有一定影響［20］。實(shí)驗(yàn)采用不同基質(zhì)代表性樣品，如茶葉（復(fù)雜基質(zhì)樣品）、檸檬（高水和高酸樣品）和大米（低水和高淀粉樣品）制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照下式計算基質(zhì)效應(yīng)（ME）：ME=（m基質(zhì)－m溶劑）/m溶劑×100%，其中m基質(zhì)和m溶劑分別為基質(zhì)和溶劑匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。結(jié)果表明，氟吡禾靈在茶葉、檸檬和大米中的基質(zhì)效應(yīng)較小，ME為－9.2%～－4.5%，ME低于20%其影響可忽略［21］。因此，本方法采用溶劑匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2.7 穩(wěn)定性

通過改變堿水解與酸中和的參數(shù)評估該方法的穩(wěn)定性［21］。用添加0.01 mg/kg 氟吡甲禾靈的茶葉樣品進(jìn)行考察，堿水解時，將5 mol/L NaOH 的體積由2 mL改變?yōu)?.5 mL；酸中和時，將2.5 mol/L H2SO4的體積由2 mL（溶液的pH ≈4～5）改變?yōu)?.5 mL（溶液的pH ≈6～7）。結(jié)果表明，改變堿水解參數(shù)前獲得的平均回收率為94.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=5）為5.6%，改變后獲得的平均回收率降至87.2%（RSD 為4.2%，n=5）；改變酸中和參數(shù)前獲得的平均回收率為94.5%（RSD 為2.5%，n=5），改變后獲得的平均回收率為98.3%（RSD為7.3%，n=5）。結(jié)果表明，堿水解5 mol/L NaOH 體積的改變對方法穩(wěn)健性的影響顯著。因此在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格控制，以避免結(jié)果的偏離。

2.8 方法學(xué)考察

2.8.1 線性范圍 通過內(nèi)標(biāo)法（氟吡禾靈-D4作為內(nèi)標(biāo)，質(zhì)量濃度為50 ng/mL）配制2.5、5.0、10、25、50 ng/mL的系列基質(zhì)匹配和溶劑匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行LC－MS/MS分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/L），分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，氟吡禾靈在2.5～50 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.999。

2.8.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 取空白樣品，分別添加氟吡禾靈、氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平為0.01、0.05、0.1 mg/kg，每個水平重復(fù)5次，并根據(jù)氟吡禾靈的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈水解為氟吡禾靈的轉(zhuǎn)化系數(shù)（分子量比分別為1.04和1.20）計算最終的回收率結(jié)果。本方法同時還能監(jiān)測氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈水解后的殘留情況。結(jié)果表明，檸檬、柑橘、馬鈴薯、結(jié)球甘藍(lán)、甜椒、洋蔥、大米、葵花籽及茶葉9種基質(zhì)的平均回收率為80.7%～114%，RSD為1.4%～11%（見表2）。

表2 空白樣品的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 2 Mean recoveries and RSDs in blank samples（n=5）

2.8.3 定量下限 在歐盟（EU）No.396/2005法規(guī)［6］中，大多數(shù)植物源性食品中總氟吡禾靈的最大允許殘留限量（MRL）低至0.01 mg/kg。本方法的定量下限（LOQ）采用加標(biāo)回收方法進(jìn)行驗(yàn)證，檸檬、柑橘、馬鈴薯、大米、茶葉等9 種樣品的LOQ 均能達(dá)到0.01 mg/kg，滿足國內(nèi)外法規(guī)對總氟吡禾靈殘留限量的檢測要求。

2.9 實(shí)際樣品的檢測

應(yīng)用本方法檢測檸檬、柑橘、馬鈴薯、結(jié)球甘藍(lán)、甜椒、洋蔥、大米、葵花籽、茶葉及小麥等樣品中的總氟吡禾靈殘留，結(jié)果在2批次的小麥粉樣品中檢出總氟吡禾靈，殘留量分別為0.03、0.12 mg/kg，其余樣品均未檢出。

3 結(jié) 論

本研究建立了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜快速分析植物源性食品中總氟吡禾靈的方法。優(yōu)化的前處理步驟可將氟吡禾靈酯類完全轉(zhuǎn)化為總氟吡禾靈；方法的線性關(guān)系良好，r2大于0.999；檸檬、柑橘、馬鈴薯、結(jié)球甘藍(lán)、甜椒、洋蔥、大米、葵花籽及茶葉9 種樣品的加標(biāo)回收率為80.7%～114%，RSD 為1.4%～11%；定量下限低至0.01 mg/kg，可滿足國內(nèi)外農(nóng)藥殘留限量法規(guī)的要求。該方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、專一性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢，為總氟吡禾靈殘留的日常監(jiān)控檢測提供了實(shí)用的技術(shù)手段。