付振海，王 敏，李志偉，秦敬燦，蘇 彤，張志宏

（1. 中國科學(xué)院青海鹽湖研究所，中國科學(xué)院鹽湖資源綜合高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；2. 青海省鹽湖資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

Mg2+是人體細(xì)胞中含量最高的二價(jià)金屬陽離子，在細(xì)胞中扮演著十分重要的角色。Mg2+能夠參與核酸和蛋白質(zhì)的合成及能量代謝，調(diào)控細(xì)胞的分化，增強(qiáng)酶的催化功能，影響Ca2+和K+的轉(zhuǎn)運(yùn)并在許多生理活動(dòng)方面發(fā)揮著重要作用［1］。從健康角度考慮，鎂離子攝取過量或者缺乏都會(huì)導(dǎo)致很多疾病，如：心臟病、神經(jīng)病、糖尿病、心腦血管疾病及帕金森綜合癥等［2－3］。因此，開發(fā)對(duì)Mg2+的高效檢測(cè)方法具有重要意義［4］。

熒光探針法因合成簡單、使用方便、高靈敏度和高選擇性等特點(diǎn)，成為近些年的研究熱點(diǎn)［5－6］。目前，已報(bào)道的Mg2+熒光探針主要集中在希夫堿、香豆素、喹啉、冠醚、二酮等結(jié)構(gòu)［7－11］。然而，由于同主族的Ca2+與Mg2+化學(xué)性質(zhì)相似，導(dǎo)致Mg2+的檢測(cè)易受到Ca2+的干擾［12－13］。因此，研究高選擇性識(shí)別鎂離子的熒光探針具有一定挑戰(zhàn)性。

由于8-羥基喹啉及其衍生物具有較強(qiáng)的配位能力，其分子內(nèi)光誘導(dǎo)質(zhì)子轉(zhuǎn)移效應(yīng)（PPT，Intermolecular photoinduced proton transfer）使得分子無法發(fā)出熒光［14］，而與金屬離子配位后可消除該效應(yīng)［15］?；诖耍狙芯渴紫雀鶕?jù)Reimer－Tiemann 反應(yīng)合成中間體8-羥基喹啉-5-醛，隨后利用8-羥基喹啉-5-醛與苯甲酰肼反應(yīng)制備出希夫堿化合物HQL，改善8-羥基喹啉熒光性能并用于識(shí)別Mg2+。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試 劑 8-羥基喹啉、4-羥基-1-萘甲醛、丙酮、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、苯甲酰肼、氫氧化鈉均為市售分析純?cè)噭?，未?jīng)處理直接使用。反應(yīng)中所用的甲醇、乙醇等溶劑均為分析純。測(cè)試中所用陽離子鹽為氯化物或硝酸鹽；測(cè)試及配制溶液所用乙醇和二甲基亞砜（DMSO）均為分析純，未經(jīng)處理直接使用；測(cè)試及配制溶液所用水為去離子水。

1.1.2 儀 器 JEOL JNM－ECS 400 MHz、INOVA 600 MHz 液體超導(dǎo)核磁共振波譜儀（1H 和13C NMR），Bruker microTOF（ESI－TOF MS）質(zhì)譜儀，Hitachi F－7000熒光光譜儀，UV－VIS2600紫外吸收光譜儀，Seven Excellence Multiparameter pH 酸度計(jì)。

1.2 探針合成

1.2.1 探針HQL的合成 探針HQL的合成路線如下所示：

8-羥基喹啉-5-醛的合成：稱?。?4.5 g，0.1 mol）8-羥基喹啉置于500 mL的三口圓底燒瓶中，加入70 mL 無水乙醇并攪拌。同時(shí)稱取37 g NaOH 溶解于63 g 去離子水中，將此NaOH 溶液滴加至燒瓶中，此時(shí)體系顏色迅速變?yōu)辄S色，有部分固體產(chǎn)生。將三口圓底燒瓶置于油浴中加熱至110 ℃回流幾分鐘至固體全部溶解，然后降溫并保持在75 ℃左右。用注射器將30 mL 氯仿緩慢加入至體系中反應(yīng)，此時(shí)溶液顏色由黃色逐漸變?yōu)楹谏?，保持溫?0 ℃攪拌12 h。待溫度降至室溫，用稀釋好的1.0 mol/L鹽酸調(diào)至pH 中性，過程中有大量黃褐色沉淀析出，攪拌0.5 h 左右，抽濾，并用水進(jìn)行洗滌，將分離得到的黃褐色固體室溫下晾干。對(duì)固體進(jìn)行硅膠柱色譜分離，淋洗劑為石油醚-乙酸乙酯體系（10∶1～5∶1，體積比），得到粉紅色固體（3.57 g，產(chǎn)率20%）。1H NMR（DMSO－D6，400 MHz）：δ11.17（s，1H），10.13（s，1H），9.55（dd，J=8.4，1.6 Hz，1H），8.97（dd，J=4.0，1.6 Hz，1H），8.16（d，J= 8.4 Hz，1H），7.78（dd，J= 8.8，4.4 Hz，1H），7.25（d，J= 8.0 Hz，1H）ppm；13C NMR（DMSO－D6，100 MHz）：δ192.2，159.6，148.9，140.3，138.0，133.1，126.8，124.6，122.4，110.9 ppm；ESI－MS：m/z174.1［M+H］+。

熒光探針HQL 的合成：稱取8-羥基喹啉-5-醛173 mg，置于50 mL 單口圓底燒瓶中，加入15 mL 甲醇，攪拌10 min后加入226.7 mg苯甲酰肼，將圓底燒瓶置于油浴中，調(diào)節(jié)溫度至68 ℃回流過夜。觀察有沉淀析出，過濾并用甲醇洗滌后得黃色粉末（169 mg，產(chǎn)率58%）。1H NMR（DMSO－D6，400 MHz）：δ11.80（s，1H），10.42（s，1H），9.61（d，J= 8.8 Hz，1H），8.94（d，J= 2.8 Hz，1H），8.83（s，1H），7.95（d，J= 7.2 Hz，2H），7.78（d，J= 8.0 Hz，1H），7.74（dd，J= 8.8，4.0 Hz，1H），7.63－7.59（m，1H），7.57－7.53（m，2H），7.17（d，J= 8.0 Hz，1H）ppm；13C NMR（DMSO－D6，100 MHz）：δ154.9，153.1，148.2，139.9，139.2，138.3，132.6，128.7，128.5（2C），126.3，122.7，122.4，120.4，119.8（2C），111.3 ppm；ESI－MS：m/z292.2［M+H］+。

1.2.2 分子HNL的合成 分子HNL的合成路線為：

HNL 的合成：稱取4-羥基-1-萘甲醛258 mg，置于50 mL 單口圓底燒瓶中，加入20 mL 乙醇，攪拌10 min后加入265.5 mg苯甲酰肼，將圓底燒瓶置于油浴中，調(diào)節(jié)溫度至78 ℃回流過夜。冷卻至室溫后有沉淀析出，過濾并用乙醇洗滌后得粉末（220.1 mg，產(chǎn)率50.5%）。1H NMR（DMSO－D6，600 MHz）：δ11.90（s，1H），10.92（s，1H），9.07（s，1H），9.04（d，J=6.0 Hz，1H），8.34（d，J=12.0 Hz，1H），8.04（d，J= 6.0 Hz，2H），7.84（d，J= 6.0 Hz，1H），7.67－7.64（m，1H），7.57－7.52（m，4H），7.05（d，J= 12.0 Hz，1H）ppm；13C NMR（DMSO－D6，100 MHz）：δ163.2，156.0，149.0，133.8，131.9，131.7，130.4，128.6（2C），127.8，127.7（2C），125.2，124.9，124.5，122.9，120.6，108.2 ppm。

1.3 熒光測(cè)試

測(cè)試所用金屬離子Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+、Mg2+、Ba2+、Ca2+、Sr2+、Cd2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Cr3+、Cu2+、Fe2+、Fe3+和Co2+的儲(chǔ)備液用去離子水配制，探針分子HQL和分子HNL 的儲(chǔ)備液（10.0 mmol/L）用DMSO 配制。取2.0 mL 二甲基亞砜－4-羥乙基哌嗪乙磺酸（DMSO－HEPES）緩沖溶液（20 mmol/L，pH 7.0，95∶5，體積比，下同）作為測(cè)試溶劑。激發(fā)波長為420 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5.0 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針對(duì)Mg2+的熒光識(shí)別

首先研究了探針HQL 對(duì)金屬離子的熒光光譜響應(yīng)。如圖1 所示，在420 nm 光照激發(fā)下，探針HQL 的溶液幾乎沒有熒光峰，這歸因于探針結(jié)構(gòu)中8-羥基喹啉的分子內(nèi)光誘導(dǎo)質(zhì)子轉(zhuǎn)移效應(yīng)。分別加入金屬離子Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+、Mg2+、Ba2+、Ca2+、Sr2+、Cd2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Cr3+、Cu2+、Fe2+、Fe3+和Co2+，其中Mg2+、Cd2+、Zn2+的加入使得探針溶液熒光增強(qiáng)。當(dāng)加入Mg2+后，探針體系在577 nm 處發(fā)出較強(qiáng)的熒光峰，加入Ca2+后熒光峰無顯著變化，而已報(bào)道的Mg2+熒光探針主要在有機(jī)溶劑中使用，可能會(huì)受到Ca2+的干擾［3,13,16－18］。相比之下，探針HQL 在含5%水－有機(jī)溶劑（DMSO－HEPES 緩沖液）混合體系中對(duì)Mg2+表現(xiàn)出較好的選擇性，具有較強(qiáng)的應(yīng)用性能。此外，加入Cd2+和Zn2+后，體系分別在604 nm 和611 nm 處出現(xiàn)不同強(qiáng)度的熒光峰。這些變化表明探針HQL 能夠以熒光增強(qiáng)響應(yīng)模式，利用發(fā)射峰強(qiáng)度和波長區(qū)分識(shí)別Mg2+和Ca2+、Cd2+和Zn2+。

圖1 探針HQL（10.0 μmol/L）對(duì)金屬離子（1.0 mmol/L）的熒光響應(yīng)光譜Fig.1 Fluorescence response of probe HQL（10.0 μmol/L）to various metal ions（1.0 mmol/L）

為進(jìn)一步考察探針對(duì)Mg2+的選擇性，進(jìn)行了其他陽離子對(duì)HQL－Mg2+體系的競(jìng)爭干擾實(shí)驗(yàn)。探針HQL 濃度為10.0 μmol/L，分別加入1.0 mmol/L 的金屬陽離子后，再加入1.0 mmol/L 的Mg2+。如圖2 所示，Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+、Ba2+、Ca2+和Sr2+存在下，探針對(duì)Mg2+的熒光選擇未受到明顯干擾。然而在過渡金屬離子共存的情況下，探針對(duì)Mg2+的熒光選擇性會(huì)受到不同程度的影響，尤其是Ni2+、Cr3+、Cu2+、Fe2+、Fe3+和Co2+會(huì)嚴(yán)重破壞探針HQL 識(shí)別Mg2+，這主要是由于探針分子中的羥基喹啉與這些金屬離子的配位能力較與Mg2+強(qiáng)所致。因此，在無過渡金屬離子存在的情況下，探針HQL 對(duì)Mg2+具有選擇性識(shí)別能力。

圖2 其他陽離子對(duì)Mg2+的競(jìng)爭干擾響應(yīng)Fig.2 Selectivity of HQL toward Mg2+in the presence of various metal ions

2.2 Mg2+濃度對(duì)探針熒光光譜的影響

考察了探針HQL 溶液的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度隨Mg2+濃度的變化情況。如圖3 所示，隨著Mg2+在探針溶液中濃度的增加，577 nm 處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸升高。當(dāng)Mg2+濃度達(dá)到1.0 mmol/L 時(shí)，熒光增強(qiáng)趨勢(shì)出現(xiàn)拐點(diǎn)，繼續(xù)增加Mg2+濃度，體系熒光發(fā)射峰強(qiáng)度緩慢升高。Mg2+濃度（x，μmol/L）在0～25 μmol/L 范圍內(nèi)與577 nm 處的熒光強(qiáng)度（y）呈良好的線性關(guān)系：y=16.876 67 + 2.757 99x，r2= 0.999 3。通過公式LOD =K×δ/S（信噪比K= 3，S為擬合直線的斜率，δ是10 次探針HQL 熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差）計(jì)算得到HQL 對(duì)Mg2+的檢出限（LOD）為8.2 ×10－8mol/L。

圖3 探針HQL（10.0 μmol/L）對(duì)不同濃度Mg2+的熒光響應(yīng)Fig.3 Fluorescence responses of HQL（10.0 μmol/L）with variable Mg2+concentrations

2.3 探針與Mg2+之間的Job曲線

為確定體系中探針HQL 和Mg2+之間的化學(xué)計(jì)量比，保持探針和Mg2+的總濃度為1.0×10－4mol/L，調(diào)整兩者之間的濃度比，基于577 nm 處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度得到工作曲線（圖4）?？梢钥闯觯跦QL］/（［HQL］+［Mg2+］）=0.67處有一個(gè)交點(diǎn)，說明HQL與Mg2+之間是2∶1配位。

圖4 探針HQL與Mg2+的Job工作曲線Fig.4 Job’s plots of HQL and Mg2+

2.4 探針對(duì)Mg2+的識(shí)別機(jī)理

為深入了解探針HQL 和Mg2+之間的相互作用，以4-羥基-1-萘甲醛和苯甲酰肼反應(yīng)制備分子HNL，觀察該溶液中加入Mg2+前后的熒光光譜變化。如圖5 所示，加入Mg2+后，HNL 溶液的熒光峰強(qiáng)度無明顯變化，表明探針HQL 分子中與Mg2+配位的是N和—OH。在此基礎(chǔ)上，基于Gaussian09高斯軟件，以B3LYP/6－31G（d）基組進(jìn)行理論優(yōu)化計(jì)算。如圖6 所示，8-羥基喹啉和HQL 的能級(jí)差分別為4.51 eV 和3.72 eV，但是由于分子內(nèi)光誘導(dǎo)質(zhì)子轉(zhuǎn)移效應(yīng)，8-羥基喹啉和探針HQL 自身不能發(fā)出熒光。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HQL 與Mg2+結(jié)合之后，其能級(jí)差進(jìn)一步縮小，且電子云向Mg2+中心靠近，密度增大，并在熒光光譜中表現(xiàn)出熒光發(fā)射峰增強(qiáng)。這主要是由于探針與Mg2+形成配位后，抑制了分子內(nèi)的光誘導(dǎo)質(zhì)子轉(zhuǎn)移效應(yīng)。因此，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論分析，可以推測(cè)其識(shí)別過程如圖7所示。

圖5 HQL和HNL對(duì)Mg2+的熒光光譜響應(yīng)Fig.5 Fluorescence response of HQL and HNL toward Mg2+ion

圖6 8-羥基喹啉、HQL與2HQL+Mg2+的HOMO與LUMO能級(jí)圖Fig.6 HOMO and LUMO energy levels of 8-hydroxyquinoline，HQL and 2HQL+Mg2+

圖7 探針HQL與Mg2+之間的作用關(guān)系Fig.7 Proposed interaction of probes HQL with Mg2+ions

3 結(jié) 論

本文基于8-羥基喹啉-5-醛與苯甲酰肼反應(yīng)制備出熒光探針用于Mg2+識(shí)別，在含水5%的溶液中，該探針能夠通過577 nm 處的熒光增強(qiáng)選擇性識(shí)別Mg2+，還可以利用604、611 nm 處的熒光增強(qiáng)來區(qū)分識(shí)別Cd2+和Zn2+。探針結(jié)構(gòu)中的N 和—OH 與Mg2+之間以2∶1 的比例發(fā)生配位，且配位后的體系能級(jí)差縮小，電子云密度增大，從而實(shí)現(xiàn)熒光增強(qiáng)對(duì)Mg2+進(jìn)行檢測(cè)。