周秋敏，賴艷瓊，李秋旸，張艷麗*，王紅斌，楊文榮，2，龐鵬飛*

（1. 云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650500；2. 迪肯大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，澳大利亞維多利亞州 吉朗 3217）

蘆?。≧utin）又稱蕓香苷、維生素P，是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于蕓香葉、煙葉、橙皮、番茄、槐花米和蕎麥花等植物中［1］。蘆丁具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗病毒、清除自由基等生理和藥理作用［2－4］，能降低毛細(xì)血管通透性和脆性，保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性，可用于防治腦溢血、高血壓、視網(wǎng)膜出血、紫癜和急性出血性腎炎等疾病，也用作食品抗氧化劑、營養(yǎng)增強(qiáng)劑和色素等。隨著蘆丁中藥材及其制劑在日常生活中的應(yīng)用越來越廣泛，建立快速、簡便、準(zhǔn)確的蘆丁含量的測定方法具有重要意義。目前，蘆丁的測定方法主要有高效液相色譜法［5－6］、毛細(xì)管電泳法［7－8］、光度分析法［9－10］、流動(dòng)注射分析法［11－12］、電化學(xué)分析法［13－19］和熒光分析法［20－24］等。其中，電化學(xué)和熒光分析方法具有樣品前處理簡單、響應(yīng)速度快、檢測成本低、選擇性好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在中藥有效成分蘆丁含量的測定方面得到了廣泛應(yīng)用。

金屬納米簇（Metal nanoclusters）是一類新型功能納米材料［25］，是由幾個(gè)到幾十個(gè)金屬原子組成的團(tuán)簇，直徑通常小于2 nm。獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，如超小尺寸、HOMO－LUMO 躍遷、強(qiáng)的發(fā)光性能及良好的穩(wěn)定性和生物相容性，使金屬納米簇在生物傳感、催化、標(biāo)記、成像和治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［26］。金納米簇（Gold nanoclusters，AuNCs）是一種可發(fā)射熒光的納米團(tuán)簇［27］，具有制備方法相對簡便、尺寸超小、熒光較強(qiáng)、熒光量子產(chǎn)率和穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，成為目前倍受關(guān)注和研究最廣泛的金屬納米簇，已被用于細(xì)胞成像、離子檢測、化學(xué)傳感等領(lǐng)域［28－31］。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料和有毒的熒光量子點(diǎn)相比，金納米簇具有毒性低、熒光性能穩(wěn)定、生物相容性好、發(fā)射波長可調(diào)及易于制備等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于熒光傳感分析中［27］。

本文以牛血清白蛋白（BSA）為模板，制備金納米簇－牛血清白蛋白（AuNCs－BSA）熒光探針，構(gòu)建了無酶無標(biāo)記熒光分析方法用于蘆丁的傳感檢測。采用透射電鏡、紫外－可見光譜和熒光光譜表征了AuNCs－BSA 的形貌和光學(xué)特性，探索了蘆丁對AuNCs－BSA 的熒光猝滅機(jī)理，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，研究了AuNCs－BSA熒光探針對蘆丁的選擇性及定量測定，并用于實(shí)際樣品分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F－7000 熒光光譜儀（日本株式會(huì)社日立制作所）；TU－1950 紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；JEM－2100透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）。

蘆丁（HPLC ≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma 公司；氯金酸（HAuCl4·4H2O）購自國藥化學(xué)試劑有限公司；復(fù)方蘆丁片購自上海朝暉藥業(yè)有限公司。所用試劑均為分析純，使用時(shí)未經(jīng)進(jìn)一步純化，實(shí)驗(yàn)用水為無菌去離子水。

1.2 AuNCs－BSA的制備

根據(jù)文獻(xiàn)方法［32－33］改進(jìn)后制備金納米簇?zé)晒馓结?。?0 mL 50 mg/mL的BSA 溶液，置于40 ℃恒溫水浴箱中10 min，劇烈攪拌下緩慢加入10 mL 10 mmol/L 的氯金酸，充分?jǐn)嚢? min 后，再加入1 mL 1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH值為弱堿性，40 ℃下繼續(xù)攪拌反應(yīng)12 h。該過程中，溶液顏色由亮黃色變成淺棕色，最終變成深棕色，即得到AuNCs－BSA熒光探針。4 ℃避光保存，備用。實(shí)驗(yàn)所用玻璃儀器均用王水浸泡，并用水洗滌。

1.3 蘆丁測定及實(shí)際樣品分析

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，向AuNCs－BSA 溶液中加入不同濃度的蘆丁，用10 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 6.5）稀釋。設(shè)置熒光儀激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為10 nm，激發(fā)電壓為600 V，495 nm 激發(fā)波長下記錄520～720 nm 的熒光發(fā)射光譜。取商品化的復(fù)方蘆丁1 片（20 mg/片），研磨成粉后用乙醇溶解，采用0.22 μm濾紙過濾，得到樣品溶液，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

AuNCs－BSA 熒光探針的制備及對蘆丁的檢測原理如圖1 所示。以BSA 為模板，在40 ℃下調(diào)節(jié)溶液pH 值至弱堿性，以增加牛血清白蛋白的還原能力。BSA 中含有酪氨酸和半胱氨酸，具有還原性的酪氨酸，能將Au（Ⅲ）還原為Au（Ⅰ）離子及金原子，使之與半胱氨酸中的硫醇以Au—S 鍵結(jié)合固定在BSA 上，形成的AuNCs－BSA 具有強(qiáng)的熒光性能。該過程中BSA 既是還原劑也是穩(wěn)定劑。當(dāng)存在蘆丁分子時(shí)，由于BSA 與蘆丁的親和力強(qiáng)于金納米簇，金納米簇從牛血清白蛋白中釋放出來，導(dǎo)致體系熒光猝滅，基于此構(gòu)建了一種檢測蘆丁的熒光生物傳感器。

圖1 AuNCs－BSA熒光探針檢測蘆丁的原理示意圖Fig.1 Schematic illustration for the detection principle of rutin based on AuNCs－BSA fluorescent probe

2.2 AuNCs－BSA的表征

采用透射電鏡（TEM）對制備的AuNCs－BSA 進(jìn)行形貌表征。如圖2所示，AuNCs－BSA 的分散度較好，尺寸分布較為均勻，平均粒徑為2 nm 左右。圖3 為AuNCs－BSA 的熒光和紫外－可見光譜，曲線a 為AuNCs－BSA 的激發(fā)光譜，其最大激發(fā)波長為495 nm，曲線b 為AuNCs－BSA 的發(fā)射光譜，其最大發(fā)射波長為620 nm。AuNCs－BSA 的紫外－可見吸收光譜（曲線c）中，520 nm處無吸收峰（金納米簇的特征峰），未觀察到局部表面等離子體共振峰，表明制備的AuNCs-BSA 尺寸小于2 nm 或不存在較大的金納米粒子。如圖3 插圖所示，合成的AuNCs－BSA在可見光下為棕色，在365 nm紫外燈的照射下發(fā)出紅色熒光。

圖2 AuNCs－BSA的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of the prepared AuNCs－BSA

圖3 AuNCs－BSA的激發(fā)（a）、發(fā)射（b）光譜和紫外－可見吸收（c）光譜圖Fig. 3 Excitation（a）and emission（b）and UV－Vis absorption（c）spectra of AuNCs－BSA

2.3 熒光猝滅效應(yīng)

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可行性，研究了AuNCs－BSA熒光強(qiáng)度在加入蘆丁前后的變化。如圖4所示，當(dāng)不存在蘆丁時(shí)，AuNCs－BSA 體系在620 nm 處表現(xiàn)出良好的熒光信號(hào)（曲線a）；當(dāng)加入60 μmol/L蘆丁時(shí)，AuNCs－BSA 的熒光強(qiáng)度顯著降低（曲線b）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AuNCs－BSA可以作為熒光探針對蘆丁進(jìn)行定量分析。

圖4 AuNCs－BSA加入蘆丁前（a）后（b，60 μmol/L）的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescent spectra of AuNCs－BSA in absence（a）and presence of 60 μmol/L rutin（b）

2.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為了獲得良好的熒光分析性能，對實(shí)驗(yàn)條件（緩沖液pH 值、反應(yīng)溫度和時(shí)間）進(jìn)行了優(yōu)化。向體系中加入20 μmol/L 蘆丁，考察了pH 6.0～8.0對AuNCs－BSA熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)緩沖液pH 值為6.5 時(shí)，AuNCs－BSA 熒光猝滅強(qiáng)度最大，因些選擇pH 6.5 的PBS 緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？疾炝藴囟龋?5、30、35、40、45 ℃）對BSAAuNCs熒光強(qiáng)度的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，AuNCs－BSA 的熒光猝滅最大，因此實(shí)驗(yàn)選擇40 ℃作為反應(yīng)溫度。最后，考察了反應(yīng)時(shí)間（5、10、15、20、25、30、35 min）對AuNCs－BSA 熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，體系的熒光強(qiáng)度逐漸減小，當(dāng)達(dá)到30 min 時(shí)，熒光強(qiáng)度趨于平穩(wěn)，因此實(shí)驗(yàn)選擇30 min作為反應(yīng)時(shí)間。

2.5 方法檢出限

在上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，測定了AuNCs－BSA 熒光探針對不同濃度蘆丁的熒光猝滅情況。結(jié)果顯示，隨著蘆丁濃度（0、5、10、15、20、25、30、35、40、60 μmol/L）的增加，AuNCs－BSA 的熒光強(qiáng)度逐漸減小，其熒光猝滅值（IF）與蘆丁濃度（c，μmol/L）在0～60 μmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為IF=-50.2c+ 3 789，檢出限（S/N= 3）為0.63 μmol/L，相關(guān)系數(shù)（r）為0.996 0。對比了本工作與已報(bào)道工作對蘆丁的檢測性能。由表1 可見，本工作分析性能與文獻(xiàn)報(bào)道相當(dāng)，但本工作具有熒光探針制作簡單、無需標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。

表1 檢測蘆丁不同分析方法的性能比較Table 1 Analytical performance of AuNCs－BSA fluorescent probe with other works for detection of rutin

2.6 干擾實(shí)驗(yàn)

實(shí)際樣品分析中，存在的干擾物會(huì)影響測定結(jié)果，因此考察了AuNCs－BSA 熒光探針的選擇性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)蘆丁濃度為50 μmol/L 時(shí)，10 倍量的Na+、Ba2+、Ag+、Zn2+、Ca2+、K+、Pb2+金屬離子對蘆丁測定的干擾可忽略，說明該熒光探針抗干擾能力和選擇性較好。

2.7 實(shí)際樣品測定

取“1.3”制備的復(fù)方蘆丁樣品溶液，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定AuNCs－BSA的熒光響應(yīng)，平行測定3 次，結(jié)果如表2 所示。其加標(biāo)回收率為99.0%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3%，表明AuNCs－BSA熒光探針可用于實(shí)際樣品中蘆丁的分析測定。

表2 復(fù)方蘆丁片中蘆丁的測定結(jié)果（n=3）Table 2 Determined results of rutin in compound rutin tablets with AuNCs-BSA fluorescent probe（n=3）

3 結(jié) 論

本文以BSA 為模板，成功制備了AuNCs－BSA 無酶無標(biāo)記熒光探針用于蘆丁的傳感檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該探針制備簡單，且具有良好的生物相容性和高的熒光強(qiáng)度。根據(jù)蘆丁對AuNCs－BSA 熒光探針的熒光猝滅效應(yīng)，建立了熒光猝滅法測定蘆丁的分析方法。該法具有靈敏、無需任何標(biāo)記、操作簡單的優(yōu)勢，可用于實(shí)際樣品中蘆丁含量的測定。