楊 霄，劉伶俐，李小玲，肖 維，陳湘藝，謝仲桂*

（1. 湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410153；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（長(zhǎng)沙），湖南 長(zhǎng)沙 410153）

喹諾酮類（Quinolones，QNs）抗生素是人工合成的廣譜類抗生素藥物，具有抗菌譜廣、價(jià)格低、耐藥性低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床治療、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域。該類抗生素被人和動(dòng)物攝入后大部分以原藥和代謝物形式隨生物糞便和尿液排出體外，通過(guò)淋溶、滲透等多種途徑進(jìn)入地表水、地下水及土壤中，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成污染［1－2］。喹諾酮類抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，其對(duì)水生動(dòng)物細(xì)菌性感染具有良好的藥物動(dòng)力學(xué)特性和防治效果［3］。該類抗生素施用后，只有少部分被水產(chǎn)動(dòng)物吸收，大部分進(jìn)入水體、底泥等環(huán)境介質(zhì)中，不僅會(huì)刺激環(huán)境中的病原菌產(chǎn)生耐藥性，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)安全產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，而且還會(huì)通過(guò)食物鏈富集作用影響人類健康［4］。

漁業(yè)水體中喹諾酮類抗生素種類繁多，含量很低（通常為ng/L 級(jí)別）［5］，對(duì)其含量進(jìn)行檢測(cè)可為水質(zhì)監(jiān)測(cè)和水體中抗生素的分布狀況、遷移規(guī)律、降解動(dòng)態(tài)等研究提供技術(shù)支撐。目前，漁業(yè)水體中喹諾酮類抗生素檢測(cè)尚無(wú)國(guó)家或地方標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有的檢測(cè)方法主要為高效液相色譜法［6－7］和高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［8－9］。高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度高、特異性強(qiáng)，廣泛用于漁業(yè)水環(huán)境中的抗生素檢測(cè)。鹽析輔助液液萃?。⊿ALLE）是一種操作簡(jiǎn)單快速、萃取效率高的前處理技術(shù)，其影響因素主要為有機(jī)萃取劑和鹽析劑，常用的萃取劑為甲醇、乙醇、乙腈等水溶性、毒性小的有機(jī)溶劑，鹽析劑為硫酸鎂、氯化鈉、硫酸銨、氯化銨、甲酸銨、乙酸銨等環(huán)境友好的鹽類。目前，SALLE在蜂蜜、血漿、白酒、水產(chǎn)品、嬰幼兒食品、魚類和肉類等樣品的有毒有害物質(zhì)殘留檢測(cè)中應(yīng)用較多［10－15］，但在環(huán)境水體中農(nóng)藥［16－17］和抗生素［18］檢測(cè)中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。Gezahegn 等［18］建立了一種以硫酸鎂輔助乙腈鹽析萃取結(jié)合高效液相色譜測(cè)定環(huán)境水體中環(huán)丙沙星的分析方法。該方法的線性范圍寬、回收率高、操作簡(jiǎn)便快速、環(huán)境友好，在環(huán)境水體中抗生素殘留檢測(cè)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本文以乙腈為萃取劑，硫酸鎂為鹽析劑，采用SALLE 技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS/MS），建立了一種簡(jiǎn)單、快速、高效測(cè)定漁業(yè)水體中環(huán)丙沙星等7種喹諾酮類抗生素的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Access 高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）；旋渦混勻儀（美國(guó)Scilogex 公司）；氮吹儀（美國(guó)Organomation 公司）；AB135－S 精密電子天平（梅特勒－托利多公司）；超純水儀（中沃水務(wù)環(huán)?？萍加邢薰荆?/p>

甲醇、乙腈（HPLC 級(jí)，i國(guó)Merck 公司）；甲酸（LC－MS 級(jí)，美國(guó)Sigma 公司）；丙酮（HPLC 級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸銨（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氯化鈉（分析純，湖南匯虹試劑有限公司）；硫酸鎂、鹽酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.25 MΩ·cm）。

環(huán)丙沙星（CIP）、恩諾沙星（ENR）、氧氟沙星（OFL）、培氟沙星（PEF）、諾氟沙星（NOR）、洛美沙星（LOM）、氟羅沙星（FLE）標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自i國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.1 mg），用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于－20 ℃避光保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液以20%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇水溶液稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品處理

量取10 mL 水樣至50 mL 離心管中，用稀鹽酸調(diào)至pH 3.0 ± 0.05，加入5.0 mL 乙腈，渦旋混勻30 s。再加入3.5 g 硫酸鎂，渦旋混勻5 min 使其充分溶解，以6 000 r/min 離心5 min，使樣品溶液與乙腈相完全分層。將上層有機(jī)相全部轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，40 ℃氮?dú)獯抵两?，加?.50 mL 20%甲醇水溶液，渦旋混勻30 s，過(guò)0.22 μm濾膜，濾液待測(cè)定。

1.4 色譜－質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 Waters Atlantis C18色譜柱（150 mm × 2.1 mm，3.0 μm）；柱溫為30 ℃；流速為0.25 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相：A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～9.0 min，20%～80% B；9.0～11.0 min，80% B；11.0～12.0 min，80%～20% B；12.0～13.0 min，20%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子模式，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；噴霧電壓為3 500 V；離子傳輸毛細(xì)管溫度為300 ℃；蒸發(fā)溫度為350 ℃；鞘氣壓力為40 Arb，輔助氣壓力為10 Arb，碰撞氣壓力為199.983 MPa。優(yōu)化后的其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 7種喹諾酮的色譜保留時(shí)間與質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters for seven quinolones

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用的Waters Atlantis C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.0 μm）具有柱內(nèi)徑和填料粒徑小、分離度高等特點(diǎn)，是HPLC 分離中的通用型色譜柱，適用于多種藥物殘留分析。喹諾酮類化合物在甲醇－水體系中的響應(yīng)值較高，在水相中加入0.1%甲酸可改善目標(biāo)物峰形，提高目標(biāo)物的離子化效率?？紤]到目標(biāo)分析物的化學(xué)性質(zhì)差異較大，采用梯度洗脫程序可有效縮短分析時(shí)間，并去除樣品溶液中殘留的雜質(zhì)。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇－0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，采用“1.4.1”的梯度洗脫程序進(jìn)行檢測(cè)。7 種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg/L）的SRM色譜圖見圖1。

圖1 7種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg/L）的SRM色譜圖Fig.1 SRM chromatograms of the seven quinolones standard solution（5 μg/L）

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

喹諾酮類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)含有羰基等富電子基團(tuán)，易在電噴霧離子源正離子模式（ESI+）下產(chǎn)生［M+H］+分子離子。采用流動(dòng)注射進(jìn)樣方式，以10 μL/min的流速將500 μg/L的7種喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源中。在正離子模式下分別對(duì)單個(gè)喹諾酮類藥物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，獲得目標(biāo)物的分子離子峰（［M+H］+），選取各化合物的［M+H］+為母離子，優(yōu)化噴霧電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力、離子傳輸毛細(xì)管溫度等參數(shù)。然后利用二級(jí)質(zhì)譜全掃描收集各藥物母離子對(duì)應(yīng)的子離子信息，分別選取相對(duì)豐度最強(qiáng)和次強(qiáng)的子離子作為定量離子和定性離子，并優(yōu)化碰撞能。最終確定的質(zhì)譜條件如“1.4.2”所述。

2.3 SALLE方法的優(yōu)化

2.3.1 水樣pH值的影響 喹諾酮類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有羧基和叔胺基官能團(tuán)，屬于兩性、極性化合物。對(duì)于可電離的極性化合物而言，樣品溶液的pH值直接影響待測(cè)物的電離狀態(tài)和溶解性，從而對(duì)其萃取效率產(chǎn)生重要影響［18－19］。實(shí)驗(yàn)考察了不同pH值對(duì)目標(biāo)物萃取效率的影響。以空白水樣為基底，用稀鹽酸分別調(diào)節(jié)pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，然后加入10 μg/L 的喹諾酮類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后按照“1.3”方法進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH 3.0時(shí)目標(biāo)化合物的回收率較高，重現(xiàn)性較好。因此，實(shí)驗(yàn)選擇水樣pH值為3.0。

2.3.2 萃取劑的優(yōu)化 萃取劑是影響萃取率的關(guān)鍵因素。SALLE 的萃取劑一般需滿足以下條件：①密度小于水且可與水混溶；②對(duì)目標(biāo)物的萃取能力強(qiáng)；③加入鹽析劑后，樣品溶液與萃取劑分層良好，便于收集萃取劑層。實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、甲醇和丙酮3 種與水互溶的常用有機(jī)溶劑的萃取性能。結(jié)果表明，加入鹽析劑硫酸鎂后，乙腈與樣品溶液分層良好且鹽析劑完全溶解，而甲醇和丙酮與樣品溶液未出現(xiàn)明顯分層且鹽析劑溶解不完全。因此，實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為萃取劑。

同時(shí)考察了不同體積（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL）的萃取劑乙腈對(duì)萃取劑與樣品溶液分層效果和目標(biāo)物回收率的影響（見圖2）。結(jié)果表明：萃取分層后乙腈相的體積隨著乙腈用量的增加而增大。當(dāng)乙腈用量為1.0～5.0 mL 時(shí)，目標(biāo)物的萃取回收率隨著乙腈體積的增加而逐漸增大，當(dāng)乙腈用量大于5.0 mL 時(shí)，目標(biāo)物的回收率隨著乙腈體積的增加幾乎不變。為節(jié)省有機(jī)溶劑和縮短分析時(shí)間，實(shí)驗(yàn)選擇乙腈的體積為5.0 mL。

圖2 萃取劑體積對(duì)7種喹諾酮回收率的影響（n=3）Fig.2 Effect of the extraction solvent volume on the recoveries of seven quinolones（n=3）

2.3.3 鹽析劑的優(yōu)化 鹽析劑是影響萃取率的重要因素。SALLE 的鹽析劑一般需滿足以下要求：①鹽析劑難溶于萃取劑（提取溶劑）；②鹽析劑在水中的溶解度足夠大，以使鹽析作用最大化?？疾炝?種常見的鹽析劑（硫酸鎂、硫酸銨、氯化鈉和甲酸銨）對(duì)目標(biāo)化合物的萃取效率。結(jié)果表明，硫酸鎂作為鹽析劑時(shí)，萃取劑和鹽析劑的分層效果最好，目標(biāo)物的萃取回收率最高，這可能是由于鎂離子的離子電位高，鹽析作用更強(qiáng)，能更好地提高SALLE 的萃取效率［20］。因此，實(shí)驗(yàn)選擇硫酸鎂作為鹽析劑。進(jìn)一步考察了硫酸鎂的用量（1.5、2.5、3.5、4.0、4.5 g）對(duì)SALLE 富集效應(yīng)和萃取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硫酸鎂的用量在1.5～3.5 g 遞增時(shí)，萃取后乙腈相的體積增大，目標(biāo)物的萃取回收率增加；當(dāng)硫酸鎂的用量在3.5～4.5 g 遞增時(shí)，萃取后乙腈相的體積變化不大，目標(biāo)物的萃取回收率幾乎不變。因此，實(shí)驗(yàn)選擇硫酸鎂的用量為3.5 g。

2.3.4 渦旋混合時(shí)間的影響 渦旋混合影響目標(biāo)物的萃取動(dòng)力學(xué)過(guò)程。一方面，渦旋混合可加速鹽析劑在水相的溶解；另一方面，渦旋混合增強(qiáng)了乙腈與水溶液間的接觸，有利于兩相體系的形成［16］。傳質(zhì)是一個(gè)與時(shí)間有關(guān)的過(guò)程，因此渦旋混合時(shí)間對(duì)目標(biāo)物的萃取效率有重要影響［18］。實(shí)驗(yàn)考察了渦旋混合時(shí)間為1～9 min時(shí)對(duì)目標(biāo)物萃取回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)渦旋混合時(shí)間為5 min時(shí)，鹽析劑在水相中溶解完全，各目標(biāo)化合物的回收率均較高。因此，選擇最佳的渦旋混合時(shí)間為5 min。

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

用初始流動(dòng)相將喹諾酮類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 mg/L）稀釋配制成6個(gè)濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照優(yōu)化后的儀器條件進(jìn)行測(cè)定。采用外標(biāo)法定量，以待測(cè)組分的質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用在空白水樣中添加低濃度目標(biāo)組分的方法，以信噪比S/N=3和S/N=10分別確定各組分的檢出限和定量下限。結(jié)果表明，7種喹諾酮類抗生素在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.995，方法的LOD 和LOQ 分別為3～10 ng/L 和10～25 ng/L（見表2）。

表2 7種喹諾酮藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients（r2），limits of detection（LOD）and limits of quantitation（LOQ）of seven quinolones

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在空白水樣中分別添加3個(gè)不同濃度水平的喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6 次，結(jié)果如表3 所示。7 種喹諾酮的平均回收率為77.8%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.1%～10%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度好，滿足漁業(yè)水體中喹諾酮類抗生素的檢測(cè)要求。

表3 空白樣品添加7種喹諾酮的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of seven quinolones spiked in blank samples（n=6）

2.6 與其他方法的比較

表4為本方法與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的水體中喹諾酮類藥物檢測(cè)方法的比較。由表4可知，本方法具有線性范圍寬、檢出限低和回收率高等優(yōu)點(diǎn)。更為重要的是，本方法的水樣取樣量少，萃取劑毒性低且用量更少，對(duì)環(huán)境更友好。這表明本方法具有較好的應(yīng)用前景，可作為一種簡(jiǎn)便、快速、高效檢測(cè)水體中痕量喹諾酮類抗生素殘留的新方法。

表4 本方法與其他檢測(cè)水體中喹諾酮類藥物方法的對(duì)比Table 4 Comparison of the proposed method with other reported methods for determination of quinolones in water samples

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

為驗(yàn)證方法的可靠性和實(shí)用性，采用優(yōu)化的前處理方法和儀器條件對(duì)湖南省某市抽取的池塘水、湖泊水和水庫(kù)水共20 份水樣進(jìn)行分析。結(jié)果表明，有4 份水樣檢出恩諾沙星（質(zhì)量濃度為10.6～35.2 ng/L），1份水樣檢出氧氟沙星（質(zhì)量濃度為13.8 ng/L）。

3 結(jié) 論

本文采用SALLE和HPLC－MS/MS技術(shù)，建立了一種同時(shí)測(cè)定漁業(yè)水體中7種喹諾酮類抗生素的分析方法。該方法靈敏度高、選擇性好，操作簡(jiǎn)便快速。將此方法應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)，結(jié)果表明，部分漁業(yè)水體受到抗生素的污染。