徐明麗,張艷霞,景 明,康萬榮,李存祥
1 甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院,甘肅 蘭州730000;2 甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地;3 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
薰倒牛是薰倒??妻沟古僦参?,主要分布于青藏高原、甘肅、新疆和四川等地,多見于海拔1000~3000 m 的河灘、路邊和山坡上[1]。據(jù)《晶珠本草》記載:“芒澗”,苦寒,治癰疽疔瘡,散腫止痛有特效[2],民間藏醫(yī)慣用薰倒牛治療婦科炎癥[3]?,F(xiàn)代研究證明薰倒??浦参锞哂墟?zhèn)痛抗炎、抗氧化、降血糖等作用[4-6],且薰倒牛對心血管系統(tǒng)功能有改善作用。本研究采用極性萃取法將薰倒牛乙醇提取物分離成不同極性部位,對正丁醇萃取部位的降血糖作用進(jìn)行研究,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料SPF 級(jí)SD 大鼠60 只,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(甘)2011-0001,使用許可證號(hào):SYXK(甘)2011-0001。雌雄各半,200~220 g,購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,并飼養(yǎng)于其SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室。普通飼料及高脂飼料均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司加工制作。
1.2 藥品與試劑藏藥薰倒牛藥材于2016 年6月采自甘肅省永登縣武勝驛鎮(zhèn),經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院陳垣教授鑒定為薰倒??浦参顱.heterostemon 的全草,由甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提取分離得到正丁醇部位,臨用前配成所需濃度;鹽酸二甲雙胍片(北京京豐制藥集團(tuán),批號(hào):170625,規(guī)格:0.25 g×48片);正丁醇、乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠,均為分析純);1% 鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ,北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):615K0318,規(guī)格:5 g)注射液(用時(shí)以STZ 與0.1 mol/L PH 4.24 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制);SOD、GSH-PX、MDA 檢測試劑盒(建成生物工程研究所,批號(hào):20180205);BS-101型血糖檢測試紙(杭州試劑電子有限公司,批號(hào):2017322)。
1.3 儀器BG-102 型血糖儀(杭州試劑電子有限公司);3K15 型低溫高速離心機(jī)(德國Sigma 實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)股份有限公司);Epoch 型全波長酶標(biāo)儀(Bio-Tek);Practum 124-1CN 天平(多利斯科學(xué)儀器有限公司);G50 組織研磨器(卡友迪生物科技有限公司);YT-7F 型生物組織攤烤片機(jī)(湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);YB-6LF型冷凍包埋機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);Leica ASP 200 s 型全自動(dòng)組織脫水機(jī)(德國徠卡公司);奧林巴斯顯微鏡DP72 數(shù)碼成像系統(tǒng)(奧林巴斯);LeicaRM2235 型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國徠卡公司)。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 造模 選取體質(zhì)量為200~220 g 的SPF級(jí)SD 大鼠60 只,隨機(jī)抽取10 只為正常對照組,正常喂養(yǎng),其余50只用高脂飼料喂養(yǎng)30天后腹腔注射1%STZ 溶液(30 mg/kg),72 h 后取血測血糖,血糖值>16.7 mmol/L為造模成功。
1.4.2 動(dòng)物分組與給藥 將44 只造模成功大鼠隨機(jī)分成模型組8 只、陽性對照組(二甲雙胍第1周給藥濃度0.0045 g/mL,之后給藥濃度0.09 g/mL)9只,薰倒牛正丁醇萃取部位高(生藥量16.6 g/mL)、中(生藥量8.3 g/mL)、低(生藥量4.15g/mL)劑量組各9 只。各組給藥或灌胃生理鹽水,每日1 次,每次1 mL/100 g,連續(xù)30天。
1.4.3 觀察指標(biāo) 1)一般體征:觀察實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠毛色光澤程度,反應(yīng)靈敏程度,活動(dòng)強(qiáng)度及飲食、飲水、體質(zhì)量變化情況。2)血糖:大鼠尾部取血滴于血糖試紙上,血糖儀讀取血糖值。3)臟器指數(shù):心臟采血處死大鼠,摘取心、肝、脾、腎及胸腺,精密稱重并計(jì)算臟器指數(shù)。4)血脂:最后1次給藥后大鼠禁食12 h,第2天心臟采血5 mL,離心半徑13.5 cm,3 000 r/min 離心10 min,取上清血用生化檢測儀測大鼠總膽固醇(cholesterol,CHOL)、甘油三酯(triglyceride,TG)。5)心臟采血2 mL,加入抗凝管中測γ-羥基丁酸(4-hydroxybutanoic acid,GHB)。6)肝臟總超氧化歧化酶(T-SOD)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化氫酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測:取部分肝臟加入冰生理鹽水制作10% 胰腺組織勻漿,4℃下離心半徑13.5 cm,4000 r/min 離心10 min 后,分離上清液,用酶標(biāo)儀檢測T-SOD、MDA、GSH-Px 含量。7)腎臟、胰腺病理學(xué):取大鼠部分胰腺、腎臟,用4% 甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片,HE染色,顯微鏡下觀察拍照。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以xˉ±s表示,采用t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 一般體征實(shí)驗(yàn)期間,正常組大鼠攝食、飲水量正常,反應(yīng)靈敏,毛發(fā)光滑,精神狀態(tài)好。模型組毛發(fā)萎黃,反應(yīng)遲鈍,多飲,多尿,體質(zhì)量增長緩慢,各給藥組隨著給藥時(shí)間延長,一般活動(dòng)狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn),體質(zhì)量緩慢增長。
2.2 臟器指數(shù)各組大鼠心臟、肝臟、脾臟及腎臟指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。
表1 各組大鼠臟器指數(shù)比較(xˉ± s)
2.3 血脂與正常組比較,模型組、薰倒牛正丁醇萃取部位中劑量組、陽性對照組CHOL 升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位高、中、低劑量組CHOL下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與正常組比較,模型組、陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位高劑量組TG升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,正丁醇高、中、低劑量組TG 下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。
圖1 各組大鼠CHOL、TG變化情況
2.4 血糖給藥10 天后,與正常組比較,陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組血糖無顯著性差異(P>0.05);與模型組比較,陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組血糖下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),薰倒牛正丁醇萃取部位高劑量組血糖下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥20 天后,與正常組比較,薰倒牛正丁醇萃取部位低劑量組血糖無顯著性差異(P>0.05),陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位中劑量組、模型組血糖升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組血糖下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。給藥30 天后,與正常組比較,陽性對照組,薰倒牛正丁醇萃取部位低劑量組血糖無差異(P>0.05);與模型組比較,二甲雙胍組,薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組血糖下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),薰倒牛正丁醇萃取部位高劑量組血糖下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。
表2 各組大鼠給藥前后血糖變化情況(xˉ± s)
2.5 T-SOD、MDA、GSH-Px 及GHB與正常組相比,模型組、陽性對照組、正丁醇萃取高劑量組T-SOD下降明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組T-SOD升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組MDA 增高明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位低劑量組MDA下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組GSHPx 活性下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組GSH-Px 升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,其余各組GHB 升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,薰倒牛正丁醇萃取部位低劑量組GHB 降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。
表3 各組大鼠T-SOD、MDA、GSH-Px及GHB變化情況(xˉ± s)
2.6 大鼠腎臟病理學(xué)正常組大鼠腎臟腎小管、腎小球形態(tài)、結(jié)構(gòu)均正常。模型組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)模糊,腎小管出現(xiàn)融合現(xiàn)象,排列紊亂,腎小管管腔擴(kuò)張,腎小管內(nèi)有分泌液。陽性對照組腎小球系膜細(xì)胞減少,腎小管排列規(guī)則,腎小球結(jié)構(gòu)清晰。正丁醇高劑量組腎小管擴(kuò)張,腎小球排列紊亂。正丁醇中劑量組腎小球系膜細(xì)胞減少,腎小管明顯擴(kuò)張,腎小管內(nèi)有分泌液。正丁醇低劑量組腎小管管腔狹窄,腎小管出現(xiàn)融合現(xiàn)象。見圖2。
圖2 各組大鼠腎臟組織病理變化
2.7 大鼠胰腺病理學(xué)正常組胰腺腺泡及胰島完好,胰島多為圓形或者橢圓形細(xì)胞團(tuán),邊界清晰,胰島細(xì)胞排列緊密,分布均勻。模型組胰島體積減少,邊界模糊,形狀不規(guī)則,胰島細(xì)胞數(shù)量明顯減少,排列紊亂,部分細(xì)胞可見空泡變性。陽性對照組較模型組胰島細(xì)胞排列整齊,胰島細(xì)胞空泡樣變性的程度減輕。正丁醇高劑量組胰島細(xì)胞排列紊亂,部分細(xì)胞可見空泡變性。正丁醇中劑量組胰島形狀不甚規(guī)則,但邊界清晰,胰島細(xì)胞排列緊密,分布均勻。正丁醇低劑量組胰島縮小,胰島細(xì)胞完好。見圖3。
圖3 各組大鼠胰腺組織病理變化
由于現(xiàn)代人生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致糖尿病發(fā)病率居高不下,目前,2 型糖尿病的治療以西藥為主,包括降低血糖和促進(jìn)胰島素生成藥物,這兩類藥物多為化學(xué)合成劑,降糖作用顯著,但會(huì)對患者產(chǎn)生副作用[7],而中醫(yī)治療2 型糖尿病注重整體調(diào)節(jié)人體機(jī)能,降糖作用溫和、安全、可靠,對并發(fā)癥的防治效果明顯,且價(jià)格低廉[8]。因此,開發(fā)降血糖中藥新藥具有較好前景。
近年來,研究證明天然產(chǎn)物中的多種成分具有降血糖作用,比如黃酮類、三萜類、糖苷類、呫噸酮、多糖、糖苷和多肽[9]。寧萌等[10]研究發(fā)現(xiàn),麥冬提取物具有降低糖尿病大鼠FBG、TG 的作用;孟慶海等[11]研究發(fā)現(xiàn),桑葉提取物能夠降低糖尿病小鼠血糖。藏藥薰倒牛含有豐富的黃酮、生物堿、多糖成分[12-14],尤其正丁醇萃取部位黃酮類成分豐富[15],這些成分的降血糖作用值得進(jìn)一步研究。
本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),薰倒牛正丁醇萃取部位可降低2 型糖尿病大鼠空腹血糖及TG、CHOL、GHB,可降低糖尿病大鼠肝臟中的MDA,升高T-SOD 及GSH-Px活性。本研究結(jié)果表明,薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組可改善糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝紊亂,減輕糖尿病大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng),降低糖尿病大鼠血糖。