劉叢麗，董金菊，周雙玉

1 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院西區(qū)婦產(chǎn)科，湖北 襄陽441000；2 南漳縣婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，隨著Pap 涂片技術(shù)的推廣，宮頸癌的發(fā)生率和死亡率明顯降低，但是其全球病死率依然僅次于乳腺癌，居女性腫瘤第二位，而且近年來發(fā)病有年輕化趨勢［1-3］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素發(fā)展過程，包括抑癌基因的缺失失活、原癌基因的表達、細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)的異常、端粒及端粒酶功能異常等多種因素［4-5］。臨床治療以手術(shù)、化療、放療或新輔助化療為主，易造成機體免疫功能下降，甚至出現(xiàn)并發(fā)癥而導(dǎo)致死亡。因此，尋找低毒、高效、專一的抗宮頸癌藥物為該疾病相關(guān)研究之一。

紫草素（shikonin）是從紫草科植物紫草的根中提取的一種有效成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為萘醌類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等作用［6］。目前，其表現(xiàn)出很好的抗腫瘤特性，對乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等都有抑制癌細(xì)胞增殖的作用［7-9］，但對宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移及信號通路方面的研究較少。

本研究探討紫草素對人宮頸癌細(xì)胞Caski 侵襲遷移及Wnt/β-catenin信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞Caski 細(xì)胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。細(xì)胞用含10% 胎牛血清的高糖型DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合度達到80%時以1∶3傳代。

1.2 實驗試劑MTT（IM0280，Solarbio，中國）；DMSO（D8372，Solarbio，中 國）；Transwell 小 室（MCHT24H48，Millipore，美國）；Matrigel 基質(zhì)膠（356234，BD，美國）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（11965084，Hyclone，美國）；FBS（10099141，Hyclone，美國）；RIPA 裂解液（P0013B，Beyotime，中國江蘇）；SDSPAGE凝膠試劑盒（P0012A，Beyotime，中國江蘇）；Trizol（9109，Takara，日 本）；逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（RR047A，Takara，日本）；實時定量PCR 試劑盒（RR820L，Takara，日本）；兔抗β-Catenin 單克隆抗體（ab52372，Abcam，英國）；兔抗p-β-Catenin單克隆抗體（ab27798，Abcam，英國）；山羊抗兔二抗（A0208，Beyotime，中國江蘇）。

引物GSK-3β：5′-CACCTCTGGCTACCATCCTTAT-3′；5′-ATTATTGGTCTGTCCACGGTCT-3′；Wnt2B：5′-GTGTCCTGGCTGGTTCCTTA-3′；5′-AGCTGGTGCAAAGGAAAGAA-3′。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT 細(xì)胞增殖實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后配制成1.5×105/mL懸液，以每孔100 加入到96 孔板中，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，以每孔0、2、4、8、16 μg/mL 的濃度加入紫草素，每組設(shè)6 個平行孔，加入相同體積的溶媒作為空白對照，分別處理24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄去上清，每孔加入150 μL DMSO溶解MTT，于490 nm處檢測OD值，計算抑制率。

1.3.2 細(xì)胞侵襲實驗 將Transwell 小室放入24孔板，4℃預(yù)冷后，上室加入1∶4稀釋的Matrigel基質(zhì)膠，待凝固后上室加入無血清培養(yǎng)基配制的細(xì)胞懸液400 μL，細(xì)胞數(shù)為1.5×105個，下室加入20% FBS 培養(yǎng)基，待細(xì)胞沉降后上室每孔加入一定濃度紫草素，每組設(shè)6 個平行孔，加入相同體積溶媒作為空白對照，處理24 h 后，取出小室，PBS漂洗后-20℃預(yù)冷甲醇固定5 min，用棉簽輕輕拭去上室未遷移細(xì)胞，結(jié)晶紫染色5 min，PBS 漂洗，拍照，計數(shù)。

1.3.3 細(xì)胞遷移實驗 將Transwell 小室放入24 孔板，上室加入無血清培養(yǎng)基配制的細(xì)胞懸液400 μL，下室加入20% FBS 培養(yǎng)基，待細(xì)胞沉降后上室每孔加入一定濃度的紫草素，每組設(shè)6 個平行孔，加入相同體積的溶媒作為空白對照，處理24 h后，取出小室，PBS漂洗后-20℃預(yù)冷甲醇固定5 min，用棉簽輕輕拭去上室未遷移的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色5 min，PBS漂洗，拍照，計數(shù)。

1.3.4 qPCR 實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入合適終濃度紫草素，加入相同體積溶媒作為空白對照，處理24 h 后，加入1.5 mL Trizol 于冰上吹打細(xì)胞，室溫靜置5 min，13 000 rpm離心5 min，吸取上清液，加入氯仿，靜置離心，吸取上清液加入異丙醇，靜置離心，棄去上清液，75% 乙醇清洗沉淀，離心棄上清，保留沉淀干燥，用DEPC 水溶解。然后按照Takara 反應(yīng)試劑盒依次經(jīng)過去除基因組DNA反應(yīng)、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和RT-PCR進行擴增，擴增程序為：預(yù)變性：95℃、10 min、1循環(huán)數(shù)；擴增：95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、30 s、40循環(huán)數(shù)。

1.3.5 Western bloting 實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入合適終濃度紫草素，加入相同體積的溶媒作為空白對照，處理24 h后，加入RIPA裂解液，置于冰上研碎至勻漿后，4℃放置30 min，13 000 rpm離心10 min，取一部分上清液，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，另一部分上清液加入4×上樣緩沖液，煮沸變性后加到4%濃縮膠濃縮，10%分離膠分離，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、4℃孵育一抗、室溫孵育二抗、ECL 發(fā)光液顯色、X醫(yī)用膠片顯影、定影等，最后拍照分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以xˉ±s表示；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素對Caski 細(xì)胞增殖的抑制作用對照組Caski 細(xì)胞生長活躍，經(jīng)不同濃度（2、4、8、16 μg/mL）紫草素處理后，細(xì)胞生長呈現(xiàn)不同的抑制作用。在同一時間下，隨著紫草素濃度的升高，其對Caski 細(xì)胞增殖抑制率越大，相同濃度下，對Caski 細(xì)胞作用時間越長，抑制率越大，因此，紫草素對Caski 細(xì)胞增殖抑制作用具有時間-濃度依賴性。見表1。

表1 紫草素對Caski細(xì)胞增殖的抑制作用（xˉ± s）

2.2 紫草素對侵襲Caski 細(xì)胞的抑制作用隨紫草素濃度的升高，Caski 細(xì)胞侵襲數(shù)目越少，與空白對照組相比，2 μg/mL紫草素差異顯著（P＜0.05），4、8、16 μg/mL 紫草素差異極顯著（P＜0.01）。見圖1。

圖1 紫草素對Caski細(xì)胞侵襲的影響

2.3 紫草素對Caski 細(xì)胞遷移的抑制作用隨紫草素濃度的升高，Caski細(xì)胞遷移數(shù)量越少，與空白對照組比較，2 μg/mL處理組差異顯著（P＜0.05），4、8、16 μg/mL 紫草素差異極顯著（P＜0.01）。見圖2。

圖2 紫草素對Caski細(xì)胞遷移的影響

2.4 紫草素對Caski 細(xì)胞GSK-3β、Wnt mRNA 表達的促進作用與空白對照組相比，隨著紫草素濃度的升高，Caski 細(xì)胞內(nèi)GSK-3βmRNA 含量逐漸升高，Wnt mRNA含量逐漸減少（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞GSK-3β、Wnt mRNA表達量變化情況

2.5 紫 草 素 對Caski 細(xì) 胞β -Catenin、p- β -Catenin 的影響隨著紫草素處理濃度的升高，Caski 細(xì)胞內(nèi)β-Catenin 蛋白越少，p-β-Catenin蛋白越多，其中與空白對照組相比，8、16 μg/mL紫草素差異顯著（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞β-Catenin、p-β-Catenin蛋白變化情況

3 討論

紫草素已在白血病、肝癌、胃癌、乳腺癌等癌癥方面表現(xiàn)出良好的抗癌作用［10-14］。但紫草素對宮頸癌的抗癌能力方面研究報道較少，本研究發(fā)現(xiàn)紫草素可濃度-時間依賴性抑制人宮頸癌細(xì)胞系Caski細(xì)胞的增殖。

癌癥發(fā)生侵襲遷移是癌癥惡化的標(biāo)志，抑制癌癥的侵襲遷移對預(yù)防癌癥惡化具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)紫草素可有效抑制Caski 細(xì)胞的侵襲遷移，并表現(xiàn)出一定劑量依賴性。Wnt是Wnt信號通路的胞外信號，與Wnt 受體結(jié)合可激活該通路，本研究發(fā)現(xiàn)紫草素可抑制Caski細(xì)胞Wnt mRNA表達，因此，紫草素首先通過抑制Wnt分泌使Caski細(xì)胞Wnt 信號通路處于低活性狀態(tài)。Wnt 信號通路的調(diào)節(jié)關(guān)鍵在于胞內(nèi)β-Catenin 的穩(wěn)定與含量，當(dāng)β-Catenin 水平低下時，Wnt 通路關(guān)閉；反之，Wnt通路開啟。而維持β-Catenin 穩(wěn)定的關(guān)鍵蛋白是GSK-3β，在無Wnt 信號刺激情況下，胞質(zhì)內(nèi)GSK-3β能與其他蛋白例如APC、Axin 等以復(fù)合物形式磷酸化β-Catenin 氨基末端Ser/Thr 位點，使β-Catenin 泛素化降解，維持細(xì)胞內(nèi)β-Catenin 低水平狀態(tài)。在Wnt 信號刺激情況下，由細(xì)胞分泌的Wnt蛋白與細(xì)胞表面受體FZD和LRP5/6結(jié)合后觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：細(xì)胞內(nèi)蛋白Dsh（dishevelled）被活化，活化的Dsh 與Axin 及Frat1 結(jié)合，后兩者與GSK-3β和APC 基 因 形 成 復(fù) 合 物，F(xiàn)rat1 介 導(dǎo)GSK-3β從Axin脫離，不能磷酸化β-Catenin，導(dǎo)致β-Catenin 水平升高并激活下游轉(zhuǎn)錄因子，促進轉(zhuǎn)移相關(guān)因子高表達，進而促進腫瘤轉(zhuǎn)移［15］。本研究發(fā)現(xiàn)紫草素可誘導(dǎo)Caski 細(xì)胞內(nèi)GSK-3βmRNA 表達。隨著Caski 細(xì)胞內(nèi)GSK-3β表達量的增多，其與更多的β-Catenin 結(jié)合，打破胞內(nèi)β-Catenin 磷酸化平衡反應(yīng)，使更多β-Catenin 磷酸化降解，而且隨著紫草素濃度的增高，Caski 細(xì)胞內(nèi)β-Catenin 含量越少，p-β-Catenin 含量越多。大量β-Catenin 被紫草素誘導(dǎo)降解，導(dǎo)致β-Catenin 在細(xì)胞內(nèi)積累受阻，抑制β-Catenin 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TCF 相結(jié)合，進一步抑制靶基因如VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶等侵襲遷移相關(guān)因子的表達激活。

綜上所述，紫草素可通過促進Caski 細(xì)胞Wnt/β-Catenin 通路中GSK-3βmRNA 表達和p-β-Catenin 蛋白表達，抑制Wnt mRNA 表達和β-Catenin 蛋白表達，從而抑制Caski 細(xì)胞的侵襲遷移。