陳盛業(yè)，甘 宇

沈陽市第七人民醫(yī)院，遼寧 沈陽110032

糖尿病足（diabetic foot，DF）又稱為糖尿病性肢端壞疽，是由糖尿病外周血管病變和（或）神經(jīng)病變感染等因素造成足或下肢組織破壞的一種病變［1］。有研究指出［2］，發(fā)生足潰瘍或壞疽的糖尿病患者達(dá)15%以上，糖尿病足部潰瘍是85%的糖尿病患者截肢的主要原因，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。血管基底膜增厚、內(nèi)皮損傷、血液高黏滯綜合征表現(xiàn)、微循環(huán)障礙等是形成糖尿病足的主要病理基礎(chǔ)［3］，而血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）作為促血管生成的主要因子，能夠促進(jìn)血管生成及修復(fù)，改善微循環(huán)，從而加快糖尿病足潰瘍的愈合。低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在缺氧條件下能調(diào)控VEGF 轉(zhuǎn)錄來控制VEGF 表達(dá)程度。生肌玉紅膏能促進(jìn)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合，達(dá)到解毒生肌效果。本研究通過建立糖尿病足大鼠模型探討生肌玉紅膏對(duì)糖尿病足創(chuàng)面局部組織中VEGF、HIF-1α 及bFGF 表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)成年SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量200～250 g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：LNZY遼2017030。

1.2 主要試劑與儀器生肌玉紅膏源自《外科正宗》，藥物組成：當(dāng)歸、白芷、紫草、血竭、甘草、輕粉、麻油（所有藥物由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室制備，采用適量基質(zhì)調(diào)制成膏劑，外敷創(chuàng)面使用）。凡士林紗布由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供。 鏈脲佐菌素STZ（美國Sigma 公司，批號(hào)：B01106002，規(guī)格：1 g）；無菌枸櫞酸緩沖液（北京化工廠，批號(hào)：20080429）；酶聯(lián)免疫檢測儀、MK3（芬蘭雷勃公司）；bFGF（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：sc-79，規(guī)格：48T）、HIF-1α（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BKE9281，規(guī)格48T）、VEGF 酶聯(lián)免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：CYT-241，規(guī)格96T）。

1.3 動(dòng)物造模與分組60只雄性SD大鼠用高脂飼料喂養(yǎng)，2 周后禁食（不禁水）16 h，一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg（用pH 4.4 的無菌枸櫞酸緩沖液配成0.25% 濃度）；72 h 后斷尾取血，測定血糖，血糖＞12 mmol/L者為糖尿病大鼠，將糖尿病大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組各25 只。兩組動(dòng)物空腹8 h 后均以10% 水合氯醛1 mL/100 g（體質(zhì)量）腹腔注射麻醉，足背部剃毛，常規(guī)消毒，用打孔器于大鼠雙足足背部相同部位打孔，形成機(jī)械性全層皮膚圓形創(chuàng)面，直徑為2 mm，潰瘍深及筋膜層，止血后以無菌紗布包扎，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法造模后實(shí)驗(yàn)組大鼠足局部創(chuàng)面予與創(chuàng)面等面積的生肌玉紅膏油紗布覆蓋，對(duì)照組創(chuàng)面覆蓋凡士林紗布，隔日更換敷料，連續(xù)用藥14天。分別于造模后3、7、14天處死大鼠，距創(chuàng)緣0.1 cm 取材，固定于福爾馬林中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，沿創(chuàng)面最大截面切片，免疫組化法檢測大鼠足局部創(chuàng)面組織中bFGF、HIF-1α及VEGF表達(dá)。

1.5 bFGF、HIF-1α 及VEGF 含量測定石蠟切片常規(guī)脫蠟，微波抗原修復(fù)，加3% H2O2去離子水3 mL，孵育5～10 min 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 沖洗，3 min×3 次，滴加封閉，用正常山羊血清工作液3 mL，室溫孵育10～15 min，傾去，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗（bFGF、HIF-1α、VEGF），4℃過夜，室溫30～60 min，PBS 沖洗3 min×3 次，滴加生物素標(biāo)記山羊抗大鼠Ig G，37℃孵育10～15 min，PBS沖洗3 min×3 次，滴加辣根標(biāo)記鏈霉卵蛋白工作液3 mL，37℃孵育10～15 min，應(yīng)用DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，封片。高倍鏡下（200 倍）由兩名觀察者采用雙盲法對(duì)各組標(biāo)本每個(gè)切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。

1.6 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)bFGF 免疫組化標(biāo)記定位于細(xì)胞漿，細(xì)胞漿著色呈棕黃色為陽性細(xì)胞。HIF-1α蛋白表達(dá)以細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒為陽性，VEGF 陽性表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中有棕色或深黃色顆粒狀為陽性，細(xì)胞無著色為陰性。陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性（-），＞10%為陽性（+）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以xˉ±s表示，樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 bFGF 表達(dá)情況干預(yù)后bFGF 表達(dá)兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第7天bFGF表達(dá)兩組均升高，實(shí)驗(yàn)組bFGF表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05）；第14天bFGF表達(dá)進(jìn)一步下降，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組大鼠不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)bFGF表達(dá)陽性計(jì)數(shù)（±s）

表1 兩組大鼠不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)bFGF表達(dá)陽性計(jì)數(shù)（±s）

注：與對(duì)照組比較，*表示P＜0.05

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組鼠數(shù)25 25 3 d 16.7±4.8 22.6±5.2*7 d 22.5±3.5 30.6±6.1*14 d 10.0±3.8 6.4±3.7*

2.2 HIF-1α 表達(dá)情況干預(yù)第3 天HIF-1α表達(dá)兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；第7 天HIF-1α表達(dá)兩組均升高，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組（P＜0.05）；第14 天HIF-1α表達(dá)下降，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組大鼠不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)HIF-1α表達(dá)陽性計(jì)數(shù)（-x±s）

2.3 VEGF 表達(dá)情況第3 天，實(shí)驗(yàn)組VEGF 水平升高較對(duì)照組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第7天，VEGF表達(dá)量繼續(xù)升高，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組（P＜0.05），兩組間差異顯著；第14 天，兩組VEGF的表達(dá)量下降，實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)陽性計(jì)數(shù)（-x±s）

3 討論

糖尿病足為慢性進(jìn)行性疾病，西醫(yī)雖能根治，但耗費(fèi)巨大。糖尿病足屬中醫(yī)“消渴脫疽”范疇，多因瘀熱邪毒凝滯經(jīng)絡(luò)導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢，肌膚失養(yǎng)所致，臨床常用生肌玉紅膏祛腐生肌，潤膚止痛。方中當(dāng)歸、血竭活血養(yǎng)血，祛腐生肌，斂瘡止痛；輕粉、紫草、甘草清熱解毒，涼血祛腐；白芷辛溫通竅，潰膿止痛；麻油滋潤肌膚，調(diào)和諸藥。藥膏外敷滲透力強(qiáng)，能刺激毛細(xì)血管生成及擴(kuò)張，增加創(chuàng)面營養(yǎng)和血供使得肉芽組織中血管擴(kuò)張，促進(jìn)血液循環(huán)及組織供氧，加速創(chuàng)面修復(fù)愈合［4］。

糖尿病足的慢性創(chuàng)傷，特點(diǎn)是慢性缺氧，炎癥和生長因子分泌不足［5］。HIF-1 是細(xì)胞為了適應(yīng)缺氧環(huán)境而產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α是HIF-1的調(diào)節(jié)亞基，氧氣通過調(diào)節(jié)HIF-1α來調(diào)節(jié)HIF-1 的活性，因此HIF-1α的表達(dá)可以間接反映組織缺氧情況，內(nèi)皮細(xì)胞增殖或損傷導(dǎo)致血管周圍相對(duì)氧缺乏時(shí)，HIF-1α陽性表達(dá)升高。HIF-1α又可促使VEGF 轉(zhuǎn)錄激活，上調(diào)VEGF 表達(dá)并且增加VEGF mRNA 穩(wěn)定性，從而促使血管生成。本研究結(jié)果顯示，兩組HIF-1α先高表達(dá)，后逐漸下降，兩組比較差異明顯。雖然敷料能夠使創(chuàng)傷部位血管周圍缺氧程度加重引起HIF-1α表達(dá)增加，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示生肌玉紅膏能使大鼠糖尿病足潰瘍組織HIF-1α表達(dá)升高，組織缺氧加重，表明實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生大量HIF-1α來促使VEGF 表達(dá)，加快血管生成修復(fù)。HIF-1α表達(dá)逐漸下降說明組織缺氧程度改善，而且創(chuàng)面修復(fù)愈合速度較前逐漸減慢，以產(chǎn)生瘢痕。

血管生成由生長因子和受損組織中受損細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子協(xié)同作用［5］。VEGF作為促進(jìn)血管生成的主要刺激因子，是傷口愈合的主要生長因子之一。有研究指出［6］，VEGF 表達(dá)活躍期主要集中在創(chuàng)面發(fā)生后的4～8 天；而DF 傷口愈合表現(xiàn)為VEGF 表達(dá)延遲，血管生成延緩，表皮細(xì)胞再生障礙。提高VEGF 水平能特異性引起血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、血管通透性增加，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞遷移及誘導(dǎo)血管生成［7］。通過血管壁重塑和融合逐漸形成具有功能的側(cè)支動(dòng)脈循環(huán)，重建缺血組織血流供應(yīng)。VEGF 在維持和恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞完整性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可防止毛細(xì)血管丟失，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞不致發(fā)生程序性死亡，還可通過一氧化氮產(chǎn)生舒張血管平滑肌細(xì)胞，促使血流恢復(fù)，增加側(cè)枝循環(huán)血量，進(jìn)而起到保護(hù)作用［8］。本研究實(shí)驗(yàn)組VEGF 表達(dá)于第3、7 天升高，第14 天下降，但均高于對(duì)照組。其原因可能是生肌玉紅膏促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)進(jìn)而增加VEGF 表達(dá)，亦或直接提高VEGF 水平以增加血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞遷移及再生，誘導(dǎo)新血管生成。后期生成的血管逐漸改善了潰瘍組織血供及營養(yǎng)，緩解了組織缺血、缺氧情況，因此HIF-1α表達(dá)下降進(jìn)而使VEGF 表達(dá)下降。

bFGF 是一種多功能細(xì)胞生長因子，能夠趨化炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞向創(chuàng)面聚集，導(dǎo)致修復(fù)細(xì)胞大量增殖，bFGF 表達(dá)增加可上調(diào)組織修復(fù)細(xì)胞上生長因子受體活性，激活細(xì)胞增殖和肉芽組織生長，改善局部抗感染能力和營養(yǎng)狀況［7］。姚昶等［9］研究證明在創(chuàng)面修復(fù)的炎癥和增殖期，生肌玉紅膏可增加bFGF 水平，促進(jìn)創(chuàng)面膠原合成和上皮生長；塑形期bFGF 水平降低能促進(jìn)過度增生膠原降解，使其排列有序，減少瘢痕形成。生肌玉紅膏外用可促進(jìn)創(chuàng)面微循環(huán)，減少微血栓，因此增加創(chuàng)面營養(yǎng)和血供，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。進(jìn)一步證實(shí)了［10］生肌玉紅膏促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)，可能是通過調(diào)節(jié)創(chuàng)面肉芽組織中成纖維細(xì)胞生長因子bFGF 介導(dǎo)?？傊?，生肌玉紅膏可改善創(chuàng)面微循環(huán)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，其機(jī)制之一可能為調(diào)節(jié)創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)bFGF 含量。另外，王曉媛等［11］證明外用中藥可上調(diào)局部組織bFGF 表達(dá)，促進(jìn)瘡瘍局部血管生成和肉芽組織生長，改善局部營養(yǎng)狀況，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)，達(dá)到治療DF 的目的。本實(shí)驗(yàn)中敷有生肌玉紅膏的bFGF 表達(dá)量高于敷有凡士林紗布的對(duì)照組，隨著時(shí)間的延長，bFGF 表達(dá)量降低，但仍高于對(duì)照組。bFGF 表達(dá)水平的升高，提示著生肌玉紅膏促進(jìn)細(xì)胞增殖和肉芽組織生長，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。隨著創(chuàng)面的逐漸修復(fù)，bFGF表達(dá)逐漸下降，既能繼續(xù)修復(fù)創(chuàng)面細(xì)胞，增加創(chuàng)面營養(yǎng)和血供，又可防止瘢痕形成。

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料結(jié)合STZ 建立的糖尿病模型與人類2 型糖尿病的發(fā)病機(jī)制相近，長期高脂飲食誘發(fā)的高血糖狀態(tài)出現(xiàn)的2 型糖尿病符合臨床實(shí)際［12］。應(yīng)用打孔法制備糖尿病足大鼠模型，縮短了模型建立周期，確保創(chuàng)口部位、大小的相似性，以增加模型穩(wěn)定性。不足之處是打孔法造成的足潰瘍與臨床糖尿病足自然發(fā)展為潰瘍的過程不同，另外生肌玉紅膏中輕粉雖然有提毒祛腐的作用，卻在曝光或與水共煮條件下易分解而生成氯化汞及金屬汞，長期應(yīng)用易導(dǎo)致蓄積中毒，用藥后局部紅腫、瘙癢等不良反應(yīng)多由此引起［13］。因此，是否需要去輕粉還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，生肌玉紅膏在治療糖尿病足過程中能促進(jìn)bFGF、HIF-1α及VEGF 表達(dá)，初期及中期能促進(jìn)細(xì)胞增殖，加快肉芽組織生長，促進(jìn)局部血管生成，以恢復(fù)血供。后期，3 個(gè)因子表達(dá)均有下降但仍然高于對(duì)照組，顯示其可繼續(xù)促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)及愈合，改善組織缺氧狀態(tài)及營養(yǎng)狀況，還能防止瘢痕形成。