戴中亮，田 迪，張洪研，高文莉，林 苗，宋意鋒，田 雅，邢燕梅（暨南大學第二臨床醫(yī)學院，南方科技大學第一附屬醫(yī)院，深圳市人民醫(yī)院麻醉科，廣東深圳 518020）

細胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)并證實的一種新的程序性細胞死亡方式，內源性和外源性刺激信號通過不同途徑作用于炎性小體而激活caspase-1，介導細胞滲透性腫脹破裂，形成細胞膜小孔，胞內物質(如乳酸脫氫酶等)流出，IL-1β、IL-18前體裂解并誘導其他炎性因子、黏附分子等的合成和釋放，放大局部和全身炎癥反應是細胞焦亡發(fā)生的主要機制［1-3］。丙泊酚（propofol，BBF）作為臨床上應用最為廣泛的麻醉藥物之一，對機體的影響是復雜多樣的。有研究已經(jīng)證明BBF 可以介導巨噬細胞通過NOD 樣受體家族核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（NOD-like receptor family，pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥小體激活發(fā)生胱天蛋白酶-1（caspase1）依賴的炎癥性死亡，即焦亡[4]。

麻醉過程中的腦保護是近幾年麻醉專業(yè)研究的熱門問題。小膠質細胞作為神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞，是人們研究腦保護和神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的重點研究對象。線粒體產(chǎn)生的活性氧（ROS）[5-8]和線粒體自噬[9-11]和NLRP3 炎癥小體的激活密切相關。因此本研究探討B(tài)BF暴露對小膠質細胞ROS、線粒體自噬和焦亡的影響，旨在為BBF麻醉過程中的腦保護提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞系和藥物

小鼠小膠質細胞BV2 購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫，產(chǎn)品貨號0356，以體積分數(shù)為10%的胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。BBF 購自Sigma生物技術有限公司，批次D126608。

1.2 實驗儀器

熒光倒置顯微鏡（德國Leica），生物安全柜（蘇州市金凈凈化設備科技有限公司），低溫離心機（濟南云騰醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組給藥 實驗分為對照組和BBF 組兩大組，對照組在BBF 給藥的同時更換空白培養(yǎng)基，BBF組用250 μmol/L的BBF暴露3 h，每組6個重復樣本。

1.3.2 線粒體膜電位（MMP）的檢測 MMP 檢測試劑盒(JC-1)購自碧云天生物技術有限公司，產(chǎn)品編號為C2006。BV2細胞BBF暴露以后根據(jù)試劑盒提示，JC-1工作液37 ℃避光孵育20 min以后收集樣本進行檢測。陽性對照組即CCCP組，在JC-1工作液處理之前以10 μmol/L(DMEM 培養(yǎng)基稀釋)CCCP 處理細胞40 min。在熒光倒置顯微鏡下攝片，用Image J 統(tǒng)計熒光強度。

1.3.3 線粒體活性氧（mito-ROS）的檢測 MitoSOX購自Invitrogen 公司，貨號M36008。BV2 細胞BBF暴露以后根據(jù)說明書提示，MitoSOX 染料用HBSS 緩沖液稀釋至5 μmol/L，37 ℃避光孵育10 min 以后收集樣本進行檢測。在熒光倒置顯微鏡下攝片，用Image J統(tǒng)計熒光強度。

1.3.4 線粒體呼吸鏈復合物I酶活性的檢測 Complex I Enzyme Activity Microplate Assay 試劑盒購自Abcam 公司，貨號ab109720。BV2 細胞BBF 暴露以后根據(jù)試劑盒步驟提示處理樣本，實驗操作結束以后用Dipstick掃描儀檢測信號強度。

1.3.5 免疫印跡試驗 Western bloting 檢 測LC3B（abcam，ab192890）、p62（abcam，ab109012）、COX4I1（abcam，ab33985）、cathepsin B（abcam，ab214428）、NLRP3（CST，#15101）、ASC（CST，#67824）、caspase1（abcam，ab179515）、GSDMD（abcam，ab 209845）、IL-1β（abcam，ab234437）和GAPDH（abcam，ab8245）的表達。BV2 細胞BBF 暴露以后，收集細胞蛋白備用。沉淀蛋白用BCA 試劑盒(酶標儀562 nm)進行定量。經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，轉膜，5% BSA 封閉，一抗(Cytochrome C 1∶5 000;其余一抗1∶1 000)4 ℃孵育過夜(12～14 h)，HRP 標記的二抗(GAPDH 用山羊抗小鼠IgM 1∶5 000；其余蛋白用山羊抗兔IgG 1∶5 000)室溫1 h孵育，化學凝膠成像儀檢測成像，最后Image J統(tǒng)計信號強度。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行分析，采用單因素方差分析，如方差齊性選用LSD 分析，如方差不齊選用Dunnett’s T3分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BBF暴露介導BV2細胞線粒體損傷

MMP 檢測結果顯示，BBF 處理后的BV2 細胞MMP 明顯下降，GFP 熒光強度明顯增加（P＜0.01），RFP 熒光強度明顯降低（P＜0.01），見圖1。Mito-ROS結果顯示，BBF 處理后的BV2 細胞Mito-ROS 生成顯著增加（P＜0.01），見圖2。線粒體ComplexI酶活性檢測結果顯示，BBF 處理后的BV2 細胞ComplexI酶活性受到顯著抑制（P＜0.01），見圖3。

圖1 BBF暴露降低BV2細胞的MMP

圖2 BBF暴露促進BV2細胞Mito-ROS的生成

圖3 BBF暴露降低BV2細胞的線粒體復合物I的酶活性（n=6）

2.2 BBF暴露抑制BV2細胞線粒體自噬

免疫印跡結果顯示，BBF 處理以后BV2 細胞的蛋白p62（P＜0.01）和COX4I1（P＜0.05）的表達明顯增加，LC3BⅡ/I的比值明顯降低（P＜0.05），Cathepsin B重鏈的表達明顯增加（P＜0.01），Cathepsin B輕鏈的表達明顯減少（P＜0.05），見圖4。

圖4 BBF暴露抑制BV2細胞的線粒體自噬（n=6）

2.3 BBF暴露介導BV2細胞焦亡

免疫印跡結果顯示，BBF 處理以后BV2 細胞的蛋白NLRP3（P＜0.01）和ASC（P＜0.05）的表達顯著增加，caspase1 和GSDMD 剪切帶的表達顯著增加（P＜0.01），白細胞介素-1β（interleukin-1，IL-1β）的剪切（P＜0.05）和分泌（P＜0.01）均顯著增加。見圖5。

圖5 BBF暴露介導BV2細胞通過NLRP3/ASC炎癥小體激活發(fā)生caspase1依賴的焦亡（n=6）

3 討論

線粒體在細胞的穩(wěn)態(tài)中起著非常關鍵的作用，能夠為細胞的正?；顒犹峁┠芰?，對細胞的壽命起著決定性的作用[12]。眾所周知，自噬是消除受損或多余的線粒體的主要機制，稱為線粒體自噬[13]。而自噬通量障礙被認為是線粒體功能損傷，或者線粒體質量差的主要貢獻者之一。而自噬通量障礙的兩個關鍵因素是自噬小體的形成和物質的轉運[14-16]。因此本研究檢測了線粒體損傷相關的指標（包括MMP、mito-ROS、ComplexI酶活性）、線粒體自噬相關的指標（包括自噬標志蛋白LC3B、SQSTM1/p62、COX4I1）以及自噬過程中與溶媒體功能相關的酶。

本研究結果顯示，250 μmol/L的BBF處理可以導致BV2 細胞MMP 下降（P＜0.01），ComplexI酶活性下降（P＜0.01），mito-ROS 顯著增加（P＜0.01），線粒體功能受到損傷；同時，LC3B Ⅱ/I 的比值明顯下降，COX4I1 和自噬底物蛋白p62 的表達明顯增加，提示BBF 暴露導致線粒體自噬流阻滯。Cathepsin B 是自噬降解途徑中研究最廣泛的一種酶，與溶酶體降解功能息息相關[17-18]。BBF暴露后Cathepsin B-p44的顯著增加和Cathepsin B-p24的顯著減少，提示溶酶體的降解功能明顯受到抑制。上面結果共同證明BBF 可以抑制線粒體自噬。

線粒體自噬可以減少線粒體氧化應激引起的細胞應激[19]。自噬作為真核生物細胞遭遇各種應激壓力時發(fā)生的一種基本應答方式，參與細胞的多種生命活動，使細胞在各種應激條件下維持一種動態(tài)平衡狀態(tài)。BBF暴露使得小膠質細胞的自噬受到抑制，損傷或多余的細胞器清除障礙，毒性物質蓄積，細胞的正常生理活動受到影響，必然會衍生出一系列的病理情況出現(xiàn)，例如炎癥小體的異常激活。NLRP3炎癥小體是生物體內防御病原微生物的固有免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[20]。NLRP3炎癥小體通過激活caspase-1，從而促進IL-1β 和白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）等促炎細胞因子的成熟和分泌，繼而介導炎癥的發(fā)生[21]。自噬能夠負向或正向調控NLRP3 炎癥小體的激活；同時NLRP3 炎癥小體也會逆向影響自噬的作用。ROS主要來源于線粒體[22]，當線粒體內膜上的電子傳遞鏈被破壞時，ROS 會在細胞內積累，當達到一定水平時會產(chǎn)生毒性，是NLRP3 炎性小體激活過程中重要的一環(huán)，并且起著正向促進作用[23]。

有研究證明BBF可以促進巨噬細胞通過NLRP3/ASC 途徑發(fā)生caspase1依賴的焦亡[24-26]。因此本研究對BBF 暴露后BV2 細胞的焦亡情況進行了檢測，以期能夠在小膠質細胞上得到進一步的驗證。結果證明BBF 暴露后，BV2 細胞確實通過NLRP3/ASC 途徑發(fā)生焦亡，caspase1和GSDMD的活性剪切增加（均P＜0.01），IL-1β的剪切和分泌均增加（P＜0.05）。

本研究結結果同時證明BBF 可以抑制線粒體自噬，損傷線粒體功能，促進ROS 生成，而自噬和ROS均是與NLRP3炎癥小體激活密切相關的因素，而NLRP3 炎癥小體激活又證明可以活性剪切caspase1，促進焦亡終端標志GSDMD和IL-1β的剪切。

通過本研究，我們初步得出以下結論：BBF 可以通過抑制線粒體自噬，導致受傷或者多余的線粒體清除障礙，BV2 細胞線粒體整體功能受損，ROS 生成增加，NLRP3/ASC 炎癥小體激活，caspase1 活性剪切增加，其下游的GSDMD 和IL-1β 活性剪切增加，活性GSDMD 在細胞膜打孔，細胞膜結構受損，大量剪切的IL-1β分泌到細胞外，形成炎性環(huán)境，BV2細胞腫脹破裂發(fā)生炎癥性死亡。同時細胞的這種死亡方式會逆向影響線粒體自噬，形成惡性循環(huán)。當然BBF 對自噬和焦亡的調節(jié)的具體過程還需要進一步確認，這是目前本研究存在的缺陷，有待在以后的研究中加以修正。