李建昌，林善鴻，曾文鋒，秦性璋，林興華，趙玉婉（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東湛江 524001）

前列腺癌（PCa）是男性最常見的惡性腫瘤之一?；熓寝D(zhuǎn)移性前列腺癌的治療方法之一[1]。作為一線化療藥物，阿霉素（DOX）已被用于治療急性白血病、乳腺癌、霍奇金淋巴瘤、卵巢癌等[2]，但DOX對心、腦、肝、腎具有較強的毒副作用。黃連素（BBR）作為一種天然產(chǎn)物，具有抑制細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等作用[3]，且BBR 在增強DOX 的細胞毒性時具有心臟保護作用，似可成為一種抗癌輔助藥物[4]。目前研究已證實，BBR 能夠提高DOX 在乳腺癌中的療效，并降低DOX 的心臟毒性[5-6]。本研究旨在探討黃連素聯(lián)合阿霉素對PCa 細胞的影響，為PCa的治療提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人PCa 細胞系(LNCaP、PC-3、22RV1)購買于中國科學(xué)院細胞庫（中國上海），均使用RPMI-1640培養(yǎng)基(Waltham,MA,USA)培養(yǎng)，并加入10%胎牛血清(Gibco)、青霉素100 mg/L 和鏈霉素100 g/L（碧云天，中國上海）。

1.2 試劑和抗體

BBR 和DOX 購買于Solarbio（北京，中國），將其溶解在100%二甲基亞砜(DMSO)中作為儲備溶液(BBR 300 mmol/L，DOX 1 mmol/L），-20 ℃。Bax、Bcl-2抗體購買于Cell Signaling Technology(CST)，GAPDH 選自Abcam，山羊抗兔IgG-HRP 二抗購于EarthOx（美國）。

1.3 細胞增殖檢測

使用MTT 法檢測人PCa 細胞的增殖。PCa 細胞系(PC-3/LNCaP：4×103細胞/孔，22RV1：1×104細胞/孔)接種在96 孔板(NEST)中，培養(yǎng)24 h 后，采用不同濃度的BBR(0、3、6、12、24、48 μmol/L)聯(lián)合不同濃度的DOX(0、0.1、0.2、0.5、1、2 μmol/L)處理細胞48 h，以及用BBR 13 μmol/L 和DOX 1 μmol/L 分別處理細胞6、12、24、48、72 h。每孔采用0.5 g/L 的MTT 孵育細胞4 h，隨后用酶標(biāo)儀(EnSpire 2300 Multilabel Reader,PE)在492 nm 處檢測吸光度值。評估藥物對細胞生存力(%)的影響，并與Control 組細胞進行比較，Control組被指定為100%存活率。

1.4 細胞凋亡檢測

Annexin V 和PI 染色檢測細胞凋亡。實驗分為Control、BBR、DOX 和BBR+DOX 組。BBR 濃度為13 μmol/L，DOX 為1 μmol/L，藥物處理PCa 細胞24 h 后，收集細胞，PBS洗滌。使用Annexin V凋亡試劑盒(BD Pharmingen，USA)檢測細胞凋亡，在室溫用AV-FITC 避光染色15 min 后，洗滌細胞并用PI 孵育，流式細胞儀分析。

1.5 Caspase 3/7和Caspase 8活性測定

使用Caspase-Glo 3/7 和Caspase-Glo 8 活性檢測試劑盒(Promega Corporation,Madison,WI,USA)測定Caspase 3/7 和Caspase 8 的活性。實驗分為Control、BBR、DOX和BBR+DOX組。將PCa細胞接種到96 孔板(NEST Biotechnology Co.Ltd)中，加入BBR、DOX及Caspase-Glo 3/7或Caspase-Glo 8，孵育30 min后使用光度計(Berthold Sirius L,Germany)測量Caspase 3/7和Caspase 8的活性。

1.6 線粒體膜電位的測量

將PCa 細胞接種在6 孔板(1×105細胞/孔)中并孵育24 h，分別用BBR13 μmol/L 和DOX 1 μmol/L 處理。實驗分為Control、BBR、DOX 和BBR+DOX 組。采用JC-1 檢測試劑盒(Berthold Sirius L,Germany)在流式細胞儀（BD，美國）上檢測線粒體膜電位。

1.7 三磷酸腺苷（ATP）檢測

使用ATP檢測試劑盒（碧云天）檢測ATP的變化。實驗分為Control、BBR、DOX 和BBR+DOX 組。分別用BBR13 μmol/L 和DOX 1 μmol/L 處理的細胞培養(yǎng)板，每孔加入200 μL 裂解液，培養(yǎng)皿置于冰上，使細胞充分裂解，4 °C，12 000 g，離心5 min，取上清于EP管中，加入ATP 檢測工作液；常溫放置3～5 min。在EP 管中加入20 μL 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，立即用移液槍混勻，間隔3～5 s 后，用Berthold Sirius L 單管式化學(xué)發(fā)光儀檢測。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析

實驗分為Control、BBR、DOX 和BBR+DOX 組。取出藥物處理24 h 的細胞使用裂解緩沖液(RIPA，碧云天)裂解細胞獲得細胞總蛋白，整個過程均在冰上操作。BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒（碧云天，中國）檢測蛋白濃度。樣品蛋白質(zhì)通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，并電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF,Millipore,USA)膜上，然后用5%脫脂奶粉(1%Tween 20 和Tris 緩沖鹽水)封閉，將封閉后的PVDF膜放入一抗中4 ℃孵育過夜。次日，TBST沖洗PVDF 膜3 次，每次5 min，然后在室溫將其與山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶二抗(EarthOx，USA)孵育1 h。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BBR聯(lián)合DOX對PCa細胞增殖的影響

BBR 和DOX 以劑量依賴的方式抑制PCa細胞的增殖能力，與單獨使用BBR 和DOX 相比，BBR+DOX能顯著降低細胞的增殖能力(P＜0.05)，見圖1A～C。經(jīng)BBR 和DOX 處理后，細胞的融合顯著減少，細胞逐漸收縮，失去正常形狀，變成圓形，最終脫離培養(yǎng)皿。與BBR、DOX 組相比，BBR+DOX 組減少了細胞間的接觸，擴散范圍更小(圖1D)。BBR 和DOX 以時間依賴的方式抑制細胞增殖(P＜0.05)，見圖2。

圖1 BBR和DOX對PCa細胞增殖的影響

圖2 BBR聯(lián)合DOX以時間依賴的方式抑制細胞增殖

2.2 BBR聯(lián)合DOX對PCa細胞凋亡的影響

BBR+DOX 組細胞凋亡率明顯高于BBR、DOX組，BBR+DOX 可顯著增加PCa 細胞的早期和晚期凋亡率(P＜0.05)，見圖3。

圖3 BBR聯(lián)合DOX對PCa細胞凋亡的影響

2.3 BBR聯(lián)合DOX對PCa細胞線粒體膜電位和ATP水平的影響

BBR、DOX 和BBR+DOX 組均能夠降低PCa 細胞線粒體膜電位和ATP 水平，且BBR+DOX 組降低更顯著(P＜0.05)，見圖4。

圖4 BBR聯(lián)合DOX對PCa細胞線粒體膜電位和ATP水平的影響

2.4 BBR 聯(lián)合DOX 對凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響

與單一藥物組相比，BBR+DOX 組顯著增加了Bax 的表達水平，降低了抗凋亡蛋白Bcl2 的表達，顯著提高了Caspase 3/7 和Caspase 8 的活性(P＜0.01)，見圖5。

圖5 BBR聯(lián)合DOX對凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響

3 討論

PCa 是男性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年遞增[7]。DOX 是PCa 化療中常用的抗腫瘤藥物之一，然而化療的耐藥性和不良反應(yīng)成為PCa 治療的主要問題[8]。據(jù)報道，BBR 作為一種潛在的化療輔助藥物，可發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用，并降低化療藥物對心臟和肝臟的毒性[6]。因此，我們評估了BBR 與DOX聯(lián)合應(yīng)用對PCa 細胞的影響及其潛在的作用機制。凋亡是程序性細胞死亡的過程，已被確定為癌癥預(yù)防的關(guān)鍵[9-10]。本研究結(jié)果表明，BBR 對PCa 細胞增殖的抑制呈時間和濃度依賴性。雖然低水平的BBR 對PCa 細胞的作用有限，但它顯著增加了細胞凋亡水平和細胞對DOX的敏感性。BBR增強了線粒體膜電位和ATP 水平的耗竭，這是細胞凋亡早期的標(biāo)志[11]。Patil等[12]研究表明，BBR能夠刺激細胞間活性氧的積累，并進一步導(dǎo)致人膠質(zhì)母細胞瘤和乳腺癌中線粒體依賴的凋亡。Ca2+是細胞凋亡途徑的參與者，線粒體中Ca2+的大量積累會增加Ca2+的釋放并且促進細胞凋亡[13]。BBR 能夠通過增加Ca2+的產(chǎn)生和釋放，在多種癌癥細胞中促進細胞凋亡，包括胃癌細胞、口腔癌細胞、舌鱗癌細胞、膠質(zhì)母細胞瘤等[14-17]。在啟動線粒體凋亡途徑的過程中，決定性事件是線粒體外膜通透性的改變。當(dāng)線粒體外膜通透性增加時，線粒體膜間空間蛋白（尤其是細胞色素c）被釋放到細胞質(zhì)中，從而激活Caspase 家族蛋白，導(dǎo)致數(shù)百種不同的蛋白質(zhì)被裂解，從而導(dǎo)致細胞快速死亡[18]。此外，線粒體外膜通透性還受到BCL-2 蛋白家族成員的高度調(diào)控。該家族蛋白可分為促凋亡蛋白(Bax 和Bak)和抗凋亡Bcl2蛋白。Bax和Bak蛋白的激活能夠增加線粒體外膜的通透性，而Bcl2 蛋白能夠抑制Bax 和Bak 蛋白的活性[19]。本研究結(jié)果表明，BBR 提高了DOX 誘導(dǎo)的促凋亡蛋白Bax 的表達水平，降低了抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，導(dǎo)致線粒體功能障礙，進一步導(dǎo)致Caspase家族蛋白的活化，包括Caspase 3/7和Caspase 8。

總之，BBR 似可通過線粒體依賴性途徑抑制PCa細胞的增殖，增強DOX 的抗癌作用。這些潛在的機制仍需進一步的研究闡明，并確定BBR 聯(lián)合DOX 的臨床相關(guān)性。