王 堃， 鐘秀來， 羅 慶， 王天文， 譚國飛， 孟平紅

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】鴨兒芹(CryptotaeniajaponicaHassk.)是傘形科多年生野生草本植物，又名三葉芹、鴨腳板等，世界范圍內均有分布，通常生于山溝及林下較陰濕的地方[1]。鴨兒芹含有豐富的營養(yǎng)成分及藥用價值，是一種優(yōu)良的藥食同源性植物[2-3]。植物中花青素可使植物呈不同顏色，其強抗氧化能力有益于人體健康[4-5]。對不同鴨兒芹材料中花青素的合成基因CjDFR及含量進行研究，可為鴨兒芹的進一步開發(fā)及利用提供依據(jù)。【前人研究進展】編碼二氫黃酮醇還原酶(DFR，dihydroflavonol reductase)的DFR基因是處于花青素合成途徑下游基因群中重要的基因，其催化二氫黃酮醇形成不穩(wěn)定的無色花青素，對植物花色形成有重要作用[6]。目前，對DFR基因的研究中，焦淑珍等[7]通過RACE技術克隆了葡萄風信子花瓣中的2條DFR基因，通過對其研究分析表明，DFR與葡萄風信子的藍色形成密切相關；張波等[8]克隆貴妃芒果中的DFR基因發(fā)現(xiàn)，綠色果皮中的DFR基因表達量較黃色果皮中高；KIM等[9]的研究顯示，DFR基因是導致洋蔥紅、黃顏色差異的基因；AHMED等[10]對蕪菁的12個DFR基因進行研究表明，這些基因與花青素的生物合成及抗寒、抗凍性相關；LO PIERO等[11]發(fā)現(xiàn)，與紅橙相比非紅橙品種的DFR基因表達明顯下降；HELARIUTTA等[12]證實了DFR基因在花冠中的表達與花青素的積累模式有關?！狙芯壳腥朦c】目前，DFR已在多種植物中被分離鑒定，但鴨兒芹中DFR的研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】探明不同顏色鴨兒芹材料中花青素的含量及其調控基因CjDFR，為進一步開發(fā)鴨兒芹中花青素及不同品種鴨兒芹的綜合利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鴨兒芹 3種鴨兒芹材料分別為圓葉鴨兒芹(RL)、淺裂葉鴨兒芹(LL)和深裂葉鴨兒芹(DL)，均搜集于貴州省野生環(huán)境，其中圓葉綠色材料的葉柄和葉片均為綠色，淺裂葉鴨兒芹和深裂葉鴨兒芹的葉柄顏色較葉片偏紫，但深裂葉鴨兒芹葉片及葉柄紫色較淺裂葉鴨兒芹明顯(圖1)。3種材料已經(jīng)過2年的自交提純，性狀穩(wěn)定，保存于貴州省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所傘形科課題組。

2019年8月種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所試驗地中，試驗地肥力中等，自然生長。2019年11月，分別取3種不同材料鴨兒芹葉及葉柄，用錫箔紙包裹，液氮速凍后，保存于-80℃冰箱中，用于花青素含量的測定和RNA的提取。

注：A，圓葉鴨兒芹；B，淺裂葉鴨兒芹；C，深裂葉鴨兒芹。

1.1.2 試劑 無氯仿型植物總RNA提取試劑盒購自百泰克生物技術有限公司(北京)，Nanodrop ND-1000分光光度計購自Nanodrop Technologies Inc.(美國)，HiScript 1stStrand cDNA試劑盒購自諾唯贊生物科技股份有限公司(南京)，高保真PCR聚合酶Taq Plus Master Mix Ⅱ(諾唯贊生物科技有限公司，南京),回收的目的片段基因試劑盒購自TaKaRa Bio Inc(大連)，熒光PCR試劑盒為AceQ qRCR SYBR Green Master Mix購自諾唯贊生物有限公司(南京)。

1.2 花青素的提取及含量測定

從-80℃冰箱中取3種不同材料的鴨兒芹葉片和葉柄，放在研缽中，使用液氮分別將其充分磨成粉末后，取約2 g粉末放入25 mL 0.1%甲醇的酒精溶液中，室溫黑暗條件放置8 h。用0.25 μm膜過濾后，使用紫外分光光度計分別在波長為530 nm、620 nm和650 nm下的吸光度值。測得結果按照公式：OD=(OD530-OD620)-0.1(OD650-OD620)，算出吸光度值，再根據(jù)0.1個吸光度值為1個花青素單位，算出花青素含量[13]。

1.3 鴨兒芹材料總RNA的提取及cDNA的合成

植物總RNA使用無氯仿型植物總RNA提取試劑盒，按照說明書分別提取2個材料的總RNA。提取的RNA使用瓊脂糖濃度為1.5%(v/v)檢測其純度，使用Nanodrop ND-1000分光光度計檢測其濃度。提取的RNA使用HiScript 1stStrand cDNA試劑盒，按照說明書進行cDNA的合成。合成的cDNA利用滅菌的ddH2O稀釋15倍后，保存于-20℃冰箱中，用于CjDFR表達水平的檢測。

1.4 鴨兒芹CjDFR基因的克隆

將反轉錄的鴨兒芹cDNA用滅菌的ddH2O稀釋15倍后，用于基因克隆模板?？寺∫飬⒖鉴唭呵坜D錄組數(shù)據(jù)庫獲得的鴨兒芹CjDFR基因序列(T1_Unigene.35992)[14]?？寺≌蛞顲jDFR-F：5′-ATGGAGGAAAAGAGAACCGTGTGTG-3′，反向引物CjDFR-R：5′-TTATGAGATCAAACCCTTTTCTC-3′?？寺〔捎酶弑Ｕ鍼CR聚合酶Taq Plus Master Mix Ⅱ，克隆測序為94℃預變性5 min；然后按照94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.2 min，32個循環(huán)后，于72℃延伸5 min；最后12℃條件下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，使用Axygen膠回收試劑盒按照說明書，回收目的片段基因。

回收的目的片段基因，按照試劑盒說明書，連接到pMD19-T載體上。連接載體利用42℃熱激的方法轉化至大腸桿菌DH5α，涂布于含有氨芐青霉素(濃度100 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基中，37℃倒置黑暗培養(yǎng)12～14 h。挑取飽滿的單菌落于含有氨芐青霉素(濃度100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床中培養(yǎng)6～8 h。取1 μL菌液進行菌液PCR檢測，將菌液PCR檢查正確的單菌落，送到基因測序公司進行測序。

1.5 DFR進化樹分析

利用傘形科植物芹菜[15]、歐芹[16]、水芹[17]等轉錄組數(shù)據(jù)庫，尋找各傘形科植物的DFR蛋白序列。另外，利用NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫，分別查找茄科、豆科、禾本科、十字花科、薔薇科、藜科、芍藥科、?？?、葡萄科植物(表1)。利用MEGA軟件NJ計算方法構建3種鴨兒芹DFR翻譯的蛋白序列與查找的26個物種DFR蛋白序列的同源進化樹。

表1 不同物種DFR蛋白信息

1.6 CjDFR基因表達分析

CjDFR基因在3種材料中的表達水平，采用實時熒光定量PCR進行檢測。使用CFX Connect PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, CA)儀器檢測，使用的熒光PCR試劑盒為AceQ qRCR SYBR Green Master Mix(諾唯贊生物有限公司，南京)。檢測體系20 μL：熒光酶10 μL，正反引物各0.5 μL，滅菌的ddH2O 7 μL，稀釋的cDNA模板2 μL。反應程序為95℃預變性5 min；95℃變性10 s，55℃退火30 s，40個循環(huán)；65℃到95℃間每10 s升高0.5℃做熔解曲線；最后8℃保存。CjDFR基因檢測引物根據(jù)測序結果設計，其正向引物CjDFR-F：5′-ATGGAGGAAAAGAGAACCGTGTGTG-3′，反向引物CjDFR-R：5′-TTATGAGATCAAACCCTTTTCTC-3′。使用鴨兒芹CjActin為內參基因，正向引物：5′- CTGCAAAGAGCAGCTCTTCTGTGGA -3′，反向引物：5′- TGTAAGTTGTCTCGTGGATTCCTGC-3′[14]。相對定量，使用參照基因ΔCT法，表達差異等于2-ΔCT，ΔCT=CT目標基因-CTactin。相對定量是基于處理和對照間，目標基因對參考基因表達量的比較。每個樣設置3次獨立重復。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)，利用IBM Statistics 20.0分析顯著性。

2 結果與分析

2.1 鴨兒芹的花青素含量

由圖2可見，3種鴨兒芹材料花青素整體含量呈顯著性差異(P< 0.05)，圓葉鴨兒芹葉片中花青素含量為0.050 mg/100g，葉柄中為0.002 mg/100g，含量較低；深裂葉鴨兒芹中對應組織花青素含量最高，葉片和葉柄分別為2.276 mg/100g和10.929 mg/100g。此外，淺裂葉鴨兒芹和深裂葉鴨兒芹葉柄的花青素含量均顯著高于葉片。

圖2 3種鴨兒芹葉、柄中的花青素含量

2.2 鴨兒芹CjDFR基因克隆

經(jīng)測序，3個材料的該基因CDS長度均為1 005 bp(圖3)，可編碼334個氨基酸。3種鴨兒芹CjDFR堿基序列比對結果顯示一致性高達99.54%，存在14個位點差異(圖4)。由堿基序列推導的氨基酸序列同源性為98.90%，出現(xiàn)11個位點差異。

注：克隆引物用黑色箭頭標注。

圖4 圓葉、淺裂葉與深裂葉鴨兒芹CjDFR蛋白序列

2.3 鴨兒芹DFR進化樹

由圖5可見，在26個物種DFR蛋白與鴨兒芹CjDFR構建的進化樹中，各科植物DFR進化均處在各自的分枝上，進化非常保守，如茄科的辣椒、枸杞、茄子、馬鈴薯和番茄，豆科的豇豆、花生和紫花苜蓿，薔薇科的野薔薇、野草莓、沙梨和蘋果，十字花科的擬南芥、油菜、蘿卜、白菜和甘藍，禾本科的水稻和大麥等，均能聚在一起。傘形科植物鴨兒芹與芹菜、水芹、歐芹等植物，親緣關系較近。同時，從進化樹上看圓葉類型鴨兒芹與深裂型鴨兒芹DFR進化更近，水芹為中國原產(chǎn)物種與外來物種芹菜進化距離較近，表明水芹和芹菜之間DFR具有類似的進化關系。

注：NJ樹枝上的數(shù)字為bootstrap值。自檢：1000次重復。

2.4 CjDFR基因的表達

由圖6可見，CjDFR在3種材料的葉和柄的表達量有顯著差異，在淺裂和深裂葉鴨兒芹柄、葉中表達水平均顯著高于對應的圓葉鴨兒芹，且2種材料的該基因在葉柄中的表達水平高于葉片。圓葉鴨兒芹2個組織中CjDFR表達水平均極顯著低于淺裂葉鴨兒芹和深裂葉鴨兒芹。

注：同一部位不同小寫字母表示達顯著性差異。

3 討論

鴨兒芹是我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物，從鴨兒芹葉和莖中提取的酚酸類物質如木犀草素、芹菜素、對香豆酸、沒食子酸和綠原酸等，具有抗氧化、抗菌和消炎作用[16]。此外，鴨兒芹中粗纖維、粗蛋白質、粗脂肪和Vc等物質含量高于菠菜、生菜等常見栽培蔬菜，屬于營養(yǎng)價值非常高的一類蔬菜[18]。目前對鴨兒芹的研究主要在栽培生產(chǎn)上[19]，對其中活性物質的研究較少，在合成機制方面的研究更少。

花青素是植物中重要的呈色色素之一，是決定植物的葉、花和果實顏色的重要色素[20-21]，除調控顏色外，花青素在植物抗逆性方面也有重要作用[22-23]，花青素的合成途徑也是目前研究最清晰的植物次生代謝途徑之一。3種鴨兒芹材料存在顏色差異，其中葉柄的顏色差異較葉片更為明顯，通過對葉柄和葉片進行花青素含量測定，結果顯示花青素含量與植株顏色呈正相關，即顏色偏紫色的深裂葉鴨兒芹花青素含量最高，顏色偏青白色的圓葉鴨兒芹花青素含量最低，且葉柄的含量大于葉片，這也與鴨兒芹植株地上部的顏色一致。在對五葉草莓的研究中發(fā)現(xiàn)，花青素在紅色五葉草莓果實中的含量高于白色五葉草莓[24]，與該研究結果類似。

DFR是花青素合成途徑中的重要酶之一，試驗克隆得到的3個不同顏色鴨兒芹CjDFR，通過基因和氨基酸序列比對一致性分別高達99.54%和98.90%，基因序列存在14個位點差異，氨基酸序列為11個，差異可能是由于品種及生長環(huán)境的差異引起。DFR廣泛存在于各個植物中，且DFR在不同科屬植物中進化相對保守。鴨兒芹CjDFR與其他傘形科植物的DFR相距較近，處在同一分支上，推測傘形科植物中DFR的功能相似；鴨兒芹DFR與辣椒、枸杞等十字花科植物相聚較遠，其余各科植物也都處在各自的分支，表明DFR在進化上非常保守，這與王如鳳等[25]對桑樹中MmDFR的研究結果一致。另外，原產(chǎn)中國的傘形科植物水芹與外來物種芹菜DFR進化距離較近，而芹菜在中國相對水芹又被為“旱芹”，可能中國的水芹與外來物種“旱芹”之間存在某種進化關系。

3種鴨兒芹材料的CjDFR在葉片和葉柄中均有表達，且呈顯著性差異，其差異與植株不同組織中花青素含量的差異相一致，表明CjDFR表達可能與花青素的積累密切相關。DFR的表達與花青素含量的關系同植物種類有關，如紫甘薯中IbDFR的表達與花青素含量顯著相關[26]；而在荔枝中，DFR基因表達與果皮中的花青素含量無明顯聯(lián)系。同時，其他基因與DFR基因一起相互作用影響植物花青素含量，如LUO等[27]研究FLS和DFR基因產(chǎn)物競爭共同的底物，從而分別指導黃酮醇和花色苷的生物合成，進而確定花朵的白色與紅色。DFR過量表達能夠增加植物花青素含量，如POLASHOCK等[28]將蔓越莓DFR基因轉入煙草中，蔓越莓DFR基因的過表達增加了煙草模型系統(tǒng)中的花的花色素沉著，使其呈深粉色(對照為淺粉白色)，與LIU等[29]對紫小麥的研究結果一致。

4 結論

對圓葉鴨兒芹、淺裂葉鴨兒芹和深裂葉鴨兒芹中花青素含量進行測定，并克隆了其花青素合成調控基因CjDFR， 3種不同顏色的鴨兒芹材料在外觀顏色、葉形及花青素含量方面存在一定差異，其中花青素含量與材料顏色深淺呈正相關，同時CjDFR的表達量也與鴨兒芹花青素含量呈正相關。通過研究不同顏色鴨兒芹品種中花青素的含量及合成，為進一步開發(fā)鴨兒芹中花青素及不同品種鴨兒芹的綜合利用提供參考。