楊鵬杰，楊昊，何鑫，郭艷，王榮花，徐宏魁，武瑜#

內(nèi)蒙古自治區(qū)腫瘤醫(yī)院（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院）1胸外科，2放療科，3核醫(yī)學(xué)科，4乳腺腫瘤科，呼和浩特 010010

新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）在局部晚期乳腺癌治療中，具有縮瘤降期、改善遠(yuǎn)期預(yù)后等優(yōu)勢(shì)。循證醫(yī)學(xué)證據(jù)顯示，如果乳腺癌NAC可以達(dá)到病理完全緩解（pathologiccomplete response，PCR），那么其生存率將會(huì)明顯提高。因此，如何有效且準(zhǔn)確評(píng)價(jià)NAC療效是評(píng)估最佳手術(shù)時(shí)機(jī)和調(diào)整化療方案的重要前提。目前臨床上評(píng)價(jià)NAC療效主要是通過(guò)臨床查體或超聲、MRI等影像學(xué)檢查手段，但公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是病理檢查，由于病理檢查的有創(chuàng)性和療效評(píng)估的滯后性等，臨床上并未廣泛采用，因此找到一個(gè)無(wú)創(chuàng)且靈敏度和特異度較高的評(píng)價(jià)手段顯得尤為重要。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的多肽（Arg-Gly-Asp，RGD）與細(xì)胞整合素αβ是天然的受體配體，在腫瘤新生血管形成中起到了重要作用。Tc-RGD已被用于腫瘤新生血管的檢測(cè)，Tc-3PRGD是新型的Tc標(biāo)記RGD顯像劑，已被證實(shí)其靈敏度和特異度均較高。本研究旨在通過(guò)Tc-3PRGD單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（single-photon emission computed tomography，SPECT）顯像，探討其對(duì)大鼠乳腺癌模型NAC效果的評(píng)估價(jià)值，為臨床準(zhǔn)確評(píng)價(jià)NAC療效、調(diào)整化療方案及決定最佳手術(shù)時(shí)機(jī)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和藥品

SPECT，熒光顯微鏡，小動(dòng)物體表超聲診斷儀，Tc-3PRGD，表柔比星，多西他賽，環(huán)磷酰胺等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及乳腺癌大鼠模型建立

選取體重190～210 g雌性SD大鼠53只，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2012-0001。常規(guī)進(jìn)行Walker-256腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為含10%小牛血清1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO濃度培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到80%～90%時(shí)，取細(xì)胞懸液進(jìn)行種鼠腹腔內(nèi)注射（細(xì)胞數(shù)約1.0×10/ml），1周后可形成腹腔積液瘤。抽取并調(diào)節(jié)腹腔積液腫瘤懸液細(xì)胞濃度至4.0×10/ml。使用10%水合氯醛進(jìn)行大鼠腹腔麻醉，于左側(cè)腋窩皮下進(jìn)行腫瘤接種。53只雌性SD大鼠中48只為實(shí)驗(yàn)組，皮下緩存注射Walker-256腫瘤細(xì)胞懸液0.8 ml左腋窩注射；5只為空白對(duì)照組，給予生理鹽水0.8 ml左腋窩注射。待大鼠腫瘤最大直徑達(dá)到1.0 cm時(shí)行SPECT、彩色多普勒超聲及細(xì)針穿刺活細(xì)胞檢查。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

乳腺癌大鼠造模成功后，NAC前行細(xì)針穿刺活檢，NAC后取下組織標(biāo)本，行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosi，HE）染色，觀察新生血管情況及腫瘤在治療前后退縮情況。當(dāng)乳腺癌模型大鼠查體及超聲檢查示腫瘤體積達(dá)到1 cm時(shí)開(kāi)始治療，每周給藥1次，共4次，根據(jù)目前乳腺癌常用化療方案（蒽環(huán)類聯(lián)合紫杉類化療方案）進(jìn)行，其中表柔比星12.36 mg/kg，多西他賽9.27 mg/kg，環(huán)磷酰胺61.80 mg/kg，于大鼠尾靜脈注射，治療結(jié)束后1周處死所有大鼠。

1.4 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

定量分析乳腺癌模型大鼠NAC前后Tc-3PRGDSPECT顯像各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)（T/NT、T/NT），分析NAC前后乳腺癌模型大鼠彩色多普勒超聲檢查各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)（腫塊的形態(tài)、與周圍組織是否存在明顯邊界、是否含有包膜、腫瘤周邊、內(nèi)部、后方回聲情況及彩色多普勒超聲觀察血流顯像并進(jìn)行血流信號(hào)分級(jí)），以病理學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)Tc-3PRGDSPECT顯像及彩色多普勒超聲檢查對(duì)NAC療效的診斷效能。①以NAC前測(cè)得的腫瘤最大直徑為基線，根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1版（response evaluation criteria in solid tumor version 1.1，RECIST 1.1）評(píng)估 NAC 的療效，完全緩解（complete response，CR）：全部腫瘤消失；部分緩解（partial response，PR）：腫瘤最大直徑與基線相比縮小≥30%；病情穩(wěn)定（stable disease，SD）：腫瘤最大直徑與基線相比縮?。?0%或增加＜20%；疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）：腫瘤最大直徑與基線相比增加≥20%。②病理評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)Miller and Payne病理反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將NAC前活檢病理切片和NAC后病理切片進(jìn)行比較，根據(jù)腫瘤細(xì)胞消退狀況分為5級(jí)，1級(jí)為局部腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)變化，但總體數(shù)目未變；2級(jí)為腫瘤細(xì)胞數(shù)目減少＜30%；3級(jí)為腫瘤細(xì)胞數(shù)目減少30%～90%；4級(jí)為腫瘤細(xì)胞數(shù)目減少＞90%；5級(jí)為無(wú)浸潤(rùn)性腫瘤成分。其中將1級(jí)與2級(jí)定義為無(wú)效，3～5級(jí)為有效。③彩色多普勒超聲血流信號(hào)分級(jí)：依照Adler分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將腫瘤的血流信號(hào)分為0～Ⅲ4個(gè)等級(jí)，0級(jí)表現(xiàn)為病灶內(nèi)未見(jiàn)血流；Ⅰ級(jí)表現(xiàn)為少量血流，可見(jiàn)1～2處點(diǎn)狀血流或棒狀血流信號(hào)；Ⅱ級(jí)表現(xiàn)為中量血流，可見(jiàn)3～4處點(diǎn)狀血流信號(hào)或1條長(zhǎng)度超過(guò)或接近腫塊半徑的血管；Ⅲ級(jí)表現(xiàn)為豐富血流，可見(jiàn)≥3條血管或血管相互連通，交織成網(wǎng)狀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組大鼠一般情況

2周后，實(shí)驗(yàn)組48只大鼠中40只腫瘤造模成功，成瘤率83.33%（40/53），5只未見(jiàn)腫瘤成團(tuán)、左腋窩無(wú)明顯腫物，死亡3只。NAC后，40只造模成功大鼠中死亡4只，2只為CR，33只為PR，1只為SD，未見(jiàn)PD大鼠。實(shí)驗(yàn)組大鼠NAC后腫瘤最大直徑為（0.52±0.06）cm，明顯小于NAC前的（1.13±0.18）cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。

2.2 大鼠99mTc- 3PRGD 2SPECT顯像情況

實(shí)驗(yàn)組大鼠NAC前后左側(cè)腋窩部位T/NT值、T/NT值均高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠NAC后左側(cè)腋窩部位T/NT值、T/NT值均低于NAC前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）（表1）?？瞻讓?duì)照大鼠全身顯像劑分布正常，左側(cè)腋窩部位注射生理鹽水后未見(jiàn)異常顯像劑攝取增高（圖1A）；實(shí)驗(yàn)大鼠給予左側(cè)腋窩接種腫瘤細(xì)胞造模成功后可見(jiàn)顯像劑異常攝?。▓D1B）；實(shí)驗(yàn)組造模成功大鼠NAC治療后可見(jiàn)顯像劑攝取明顯下降（圖1C）。

表1 大鼠99mTc- 3PRGD 2SPECT的顯像情況（±s）

圖1 空白對(duì)照及實(shí)驗(yàn)大鼠99mTc- 3PRGD 2SPECT顯像圖

2.3 大鼠彩色多普勒超聲檢查情況

彩色多普勒超聲檢查結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠造模成功后表現(xiàn)為腫瘤呈不規(guī)則團(tuán)塊，邊界不清楚，形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)可見(jiàn)回聲不均勻，部分腫塊周邊可見(jiàn)強(qiáng)回聲帶，內(nèi)部回聲偏低、不均勻，有點(diǎn)簇狀強(qiáng)回聲鈣化灶。彩色多普勒血流顯像（color doppler flow imaging，CDFI）顯示，腫物周邊及內(nèi)部探及豐富、雜亂條狀或星點(diǎn)狀血流信號(hào)，Adler分級(jí)為Ⅲ級(jí)。實(shí)驗(yàn)大鼠NAC后腫瘤直徑較NAC前明顯縮小，CDFI顯示，與NAC前相比血流信號(hào)減少，Adler分級(jí)為0～Ⅰ級(jí)。（圖2）

圖2 空白對(duì)照及實(shí)驗(yàn)大鼠超聲顯像圖

2.4 實(shí)驗(yàn)組大鼠NAC前后病理染色情況

實(shí)驗(yàn)組大鼠NAC前腫塊大體呈不規(guī)則或結(jié)節(jié)狀，切面灰白或灰粉，可見(jiàn)灰白條紋，質(zhì)地硬，鏡下可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞呈索狀、梁狀、團(tuán)塊狀、腺管狀、實(shí)性片狀等；細(xì)胞較大，成不同形狀；細(xì)胞核明顯多形性，核仁明顯，可有多個(gè)核仁，核分裂像不等；腫塊間質(zhì)為浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞壞死和鈣化等；部分累及脈管或神經(jīng)，腫瘤新生血管明顯。實(shí)驗(yàn)組33只大鼠NAC后腫瘤明顯縮小，光鏡下殘余浸潤(rùn)性腫瘤部分表現(xiàn)為纖維間質(zhì)內(nèi)散在的條索狀、巢狀或單個(gè)的腫瘤細(xì)胞。NAC后，1只大鼠表現(xiàn)為較大的片狀癌巢，其余多數(shù)大鼠腫瘤間質(zhì)表現(xiàn)為纖維化或纖維黏液樣，伴有不等的淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞、多核巨細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)鈣化形成及含鐵血黃素沉著，部分腫瘤壞死后可形成膽固醇結(jié)晶，腫瘤新生血管明顯減少。（圖3）

圖3 實(shí)驗(yàn)組大鼠NAC前后病理染色情況（HE染色，×20）

3 討論

2020年全球腫瘤數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌在女性人群中的發(fā)病率已經(jīng)超過(guò)肺癌，是目前女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤。中國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率也居首位，占女性各種腫瘤的7%～10%。NAC是局部晚期乳腺癌治療的有效手段，并且可以使患者明顯受益，但由于不同NAC方案引起腫瘤降期不同，并不能讓所有乳腺癌患者都達(dá)到遠(yuǎn)期獲益。Cao等的研究認(rèn)為，乳腺癌患者接受NAC后，35%患者腫瘤消失達(dá)到CR，僅9%的患者達(dá)到PCR。目前評(píng)價(jià)NAC后腫瘤緩解最有效的方法是病理學(xué)檢查，而病理學(xué)有創(chuàng)操作給患者帶來(lái)較大的痛苦，同時(shí)也限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，利用無(wú)創(chuàng)方法準(zhǔn)確評(píng)估乳腺癌患者NAC后療效及手術(shù)時(shí)機(jī)把握尤為重要。

已有大量文獻(xiàn)證明腫瘤的生長(zhǎng)與腫瘤新生血管有關(guān)，Batlle等通過(guò)抑制間充質(zhì)干細(xì)胞p38α激酶活性可使血管新生明顯，進(jìn)而增加了小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生率。Nuevo-Tapioles等研究發(fā)現(xiàn)，Nebivolol作為β1受體阻斷劑可抑制內(nèi)皮增殖進(jìn)而抑制腫瘤血管生成，從而限制了結(jié)腸癌和乳腺癌的生長(zhǎng)。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)，楊梅素可下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）2和p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），其具有明顯抑制腫瘤血管生成的作用，進(jìn)而抑制乳腺腫瘤的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，大鼠乳腺癌形成后病理切片顯示腫瘤新生血管明顯，而給予化療藥物治療后腫瘤直徑縮小，新生血管明顯減少，說(shuō)明乳腺癌的發(fā)生與腫瘤新生血管密切相關(guān)，并且彩色多普勒超聲顯示NAC前CDFI中腫物周邊及內(nèi)部探及豐富、雜亂條狀或星點(diǎn)狀血流信號(hào)，Adler分級(jí)為Ⅲ級(jí)，NAC后超聲探及腫瘤大小較NAC前明顯縮小，CDFI：與治療前相比血流信號(hào)減少，血流信號(hào)減少，Adler分級(jí)為0～Ⅰ級(jí)。RGD是構(gòu)成骨橋蛋白的一種生物活性多肽，近年研究認(rèn)為其參與多種生物學(xué)過(guò)程，如新生血管形成、腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)等。研究顯示，RGD介導(dǎo)的生理功能通過(guò)與細(xì)胞表面的整合素αβ結(jié)合發(fā)揮作用。αβ是參與細(xì)胞間粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要物質(zhì)，在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、分化、凋亡起著重要作用。多項(xiàng)研究表明，αβ在乳腺癌新生血管形成中有重要作用，且αβ表達(dá)于各種乳腺癌細(xì)胞，并與腫瘤新生血管數(shù)目呈正相關(guān)，而在正常組織不表達(dá)或很少表達(dá)，提示其與乳腺癌新生血管形成有關(guān)。Engebraaten等用免疫組化分析發(fā)現(xiàn)利用抗整合素單克隆抗體能有效阻止新生血管內(nèi)皮細(xì)胞αβ的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和血管的消退，乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷RGD和整合素αβ結(jié)合可明顯減少雞胚絨毛尿囊膜新生血管的形成，而對(duì)已生成的血管沒(méi)有影響?？傊?，RGD與乳腺癌病理過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，RGD與整合素αβ結(jié)合將為乳腺癌的診治提供靶點(diǎn)。

Tc-3PRGD能特異與細(xì)胞整合素αβ結(jié)合并在SPECT顯像，該技術(shù)用于腫瘤新生血管的檢測(cè)，并被證實(shí)是靈敏度高和特異性好的方法，對(duì)腫瘤微環(huán)境及形態(tài)的變化可以進(jìn)行早期、微觀及宏觀的評(píng)估。Tc-3PRGDSPECT在多種疾病的早期診斷中都有應(yīng)用，Wu等認(rèn)為T(mén)c-3PRGDSPECT可以通過(guò)對(duì)相關(guān)滑膜新生血管的成像發(fā)現(xiàn)早期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，并可應(yīng)用于疾病管理中。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，Tc-3PRGDSPECT可提供一種非侵入性肝纖維化分級(jí)和評(píng)估肝纖維化逆轉(zhuǎn)的方法。有研究表明，使用Tc-3PRGD探討乳腺癌NAC后患者評(píng)價(jià)治療反應(yīng)時(shí)，Tc-3PRGDSPECT在第一個(gè)周期NCT后的靈敏度、特異度和陰性預(yù)測(cè)值分別為86.7%、85.7%和86.7%，在第二個(gè)周期NCT后的靈敏度、特異度和陰性預(yù)測(cè)值分別為92.9%、93.3%和93.3%；其中人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽(yáng)性組T/NT值高于其他乳腺癌亞型，且T/NT值變化較大（

P

＜0.05），HER2陽(yáng)性組中T/NT值的變化與腫瘤病理反應(yīng)有很強(qiáng)的相關(guān)性（

P

＜0.03），說(shuō)明Tc-3PRGDSPECT顯像可較好地評(píng)價(jià)乳腺癌NAC后療效的無(wú)創(chuàng)方法。本研究利用Tc-3PRGDSPECT顯像觀察實(shí)驗(yàn)組大鼠NAC治療前后顯像劑攝取變化，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組NAC前后大鼠左側(cè)腋窩部位T/NT值、T/NT值均高于空白對(duì)照組，但均低于NAC前，與病理學(xué)檢查結(jié)果基本一致，因此，Tc-3PRGDSPECT可為早期評(píng)估乳腺癌NAC療效提供更多的理論依據(jù)。

綜上所述，Tc-3PRGDSPECT顯像可以較好地評(píng)價(jià)乳腺癌NAC后的療效，與病理學(xué)檢查相比，其是一種無(wú)創(chuàng)的診斷方法。但本研究也存在一些不足，如病理學(xué)研究只是在原先實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上和文獻(xiàn)報(bào)道上，未能行免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步說(shuō)明αβ的表達(dá)情況。由于造模大鼠較少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在一定偏倚，今后的臨床和科研工作中應(yīng)進(jìn)一步探索及驗(yàn)證。