尚博文， 馮 靜， 王景軒， 陳晶華， 李 源， 施慶珊，謝小保*， 馬 秋， 郭秋彥

1.吉利汽車研究院(寧波)有限公司，浙江 寧波 315000；2.廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測(cè)中心，華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；3.杭州福兆朗風(fēng)科技有限公司，浙江 杭州 311215；4.博富科技股份有限公司，江蘇 昆山 215300

隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，汽車的保有量和普及率不斷提升?？照{(diào)系統(tǒng)作為汽車生產(chǎn)中不可缺少的設(shè)施之一，可實(shí)現(xiàn)對(duì)車內(nèi)空氣溫度、濕度的有效調(diào)節(jié)，并保持車內(nèi)空氣清潔，從而大大改善了汽車的舒適性和人們的駕乘環(huán)境。然而，汽車空調(diào)在創(chuàng)造舒適環(huán)境的同時(shí)，也會(huì)由于長(zhǎng)期運(yùn)行、不易清洗或清洗不當(dāng)?shù)仍蚨o汽車內(nèi)部造成各種污染，尤其值得關(guān)注的是微生物污染。

汽車空調(diào)微生物污染不僅會(huì)導(dǎo)致汽車空調(diào)產(chǎn)生異味，破壞車內(nèi)清新環(huán)境，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)危害人體健康，引發(fā)各種疾病。近年來，關(guān)于汽車空調(diào)異味的報(bào)道及消費(fèi)者投訴越來越多，給消費(fèi)者及汽車生產(chǎn)廠商都帶來了困擾。蒸發(fā)器屬于汽車空調(diào)的重要組成部分，因其特殊的位置環(huán)境，不易拆卸且難以清洗，有可能為汽車空調(diào)微生物的滋生和繁殖提供適宜環(huán)境。目前關(guān)于汽車空調(diào)微生物污染及相關(guān)種群調(diào)查的相關(guān)研究及報(bào)道較少?；诖?，本研究主要對(duì)汽車空調(diào)蒸發(fā)器的微生物污染情況及其表面的主要微生物種群進(jìn)行取樣調(diào)查及分離鑒定，以明確污染危害汽車空調(diào)蒸發(fā)器的主要微生物種群，為解決汽車空調(diào)異味提供前期的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 采樣蒸發(fā)器情況

以正常行駛10萬公里的某品牌汽車空調(diào)蒸發(fā)器為調(diào)查采樣對(duì)象，采樣蒸發(fā)器具體情況如下：

(1)抗菌處理組蒸發(fā)器(抗菌組)：蒸發(fā)器表面涂刷有氧化鋅抗菌涂層，取出時(shí)表面有較輕微異味，已正常運(yùn)行10萬公里。

(2)未處理組蒸發(fā)器(對(duì)照組)：蒸發(fā)器表面未經(jīng)任何處理，取出時(shí)表面異味較抗菌組稍濃，已正常運(yùn)行10萬公里。

1.2 采樣部位及方法

采用表面采樣法，分別對(duì)抗菌組及對(duì)照組蒸發(fā)器進(jìn)風(fēng)口(正面)及出風(fēng)口(背面)上不同位置進(jìn)行取樣。用無菌濕潤(rùn)的棉簽，在蒸發(fā)器表面選取合適位點(diǎn)進(jìn)行均勻擦拭后，剪掉手接觸部位，放入含有5 mL無菌生理鹽水的取樣管中，密封保存后帶回實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃保存。采樣部位涂抹區(qū)域約為5 cm×5 cm大小，每位點(diǎn)取樣次數(shù)為2次。蒸發(fā)器表面具體采樣部位及編號(hào)如圖1和表1所示。

抗菌組蒸發(fā)器正面

表1 蒸發(fā)器表面各位點(diǎn)采樣編號(hào)及具體部位

1.3 菌株的分離、純化及培養(yǎng)

將含采樣樣品的采樣管從4 ℃冰箱中取出后，分別于渦旋振蕩器上充分渦旋震蕩，分散均勻。于超凈工作臺(tái)上，用無菌移液器各吸取200 μL樣品液，分別轉(zhuǎn)移至含有營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基(NA)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)的固體平板上，涂布均勻后，分別置于不同條件的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)，分別置于37 ℃常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱、37 ℃厭氧培養(yǎng)箱及28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間后取出，觀察并記錄平板表面生長(zhǎng)的菌落數(shù)量。隨后，挑取形態(tài)各異的單菌落轉(zhuǎn)移至另一對(duì)應(yīng)的NA或PDA平板上，分別置于37 ℃(NA平板)培養(yǎng)箱和28 ℃(PDA平板)培養(yǎng)箱中進(jìn)行純培養(yǎng)后，得到經(jīng)純化后的菌株。

1.4 菌株的形態(tài)鑒定及顯微形態(tài)觀察

用無菌接種環(huán)取一環(huán)無菌水于潔凈的載玻片上，挑取少量微生物菌株菌體放入無菌水中，涂抹均勻并固定后，進(jìn)行革蘭氏染色。采用Nikon E200生物顯微鏡攝像系統(tǒng)，于10×100倍油鏡下，對(duì)菌株的顯微形態(tài)(大小、顏色、形狀等)進(jìn)行顯微觀察并拍照。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[1]及《真菌鑒定手冊(cè)》[2]等分類標(biāo)準(zhǔn)，綜合菌株的平板培養(yǎng)特性及顯微特征，結(jié)合相關(guān)微生物分類學(xué)資料進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.5 菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用16S rRNA或18S rRNA序列擴(kuò)增方法對(duì)微生物菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。挑取NA或PDA上培養(yǎng)好的菌株菌絲體，用美基生物DNA提取試劑盒(AmPure Microbial DNA Kit)提取基因組DNA。以提取到的DNA為模板，采用細(xì)菌通用16S rRNA及真菌通用18S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表2)。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司在ABI 3730XL測(cè)序儀上進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)得的DNA序列結(jié)果提交NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，并采用GenBank中的BLAST軟件進(jìn)行同源性比較，確定微生物菌株的種群分類。

表2 PCR擴(kuò)增通用引物序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌株的分離及培養(yǎng)

表3及圖2～圖4為抗菌組蒸發(fā)器各樣品在NA平板及PDA平板上經(jīng)不同培養(yǎng)條件及不同培養(yǎng)時(shí)間后，平板表面上生長(zhǎng)出的菌落情況。由圖可知，抗菌組蒸發(fā)器樣品在NA培養(yǎng)基上經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)或厭氧培養(yǎng)后，都僅有極少數(shù)樣品長(zhǎng)出了少量菌落，其余樣品上則未分離得到微生物菌落。而在PDA培養(yǎng)基上上培養(yǎng)7 d的培養(yǎng)結(jié)果則表明，A1、A3及A5樣品平板上長(zhǎng)出了數(shù)量不同的菌落，其余樣品對(duì)應(yīng)平板上則未觀察到菌落生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明，汽車空調(diào)蒸發(fā)器表面經(jīng)抗菌涂層處理后，其表面附著的微生物群落數(shù)量極少，可有效控制蒸發(fā)器表面微生物的滋生及繁殖。

表3 不同樣品培養(yǎng)一定時(shí)間后的平板菌落數(shù)

圖2 抗菌組蒸發(fā)器樣品在NA平板上常規(guī)培養(yǎng)24 h后的菌落生長(zhǎng)情況

圖3 抗菌組蒸發(fā)器樣品在NA平板上厭氧培養(yǎng)48 h后的菌落生長(zhǎng)情況

圖4 抗菌組蒸發(fā)器樣品在PDA平板上培養(yǎng)7 d后的菌落生長(zhǎng)情況

圖5～圖7為對(duì)照組蒸發(fā)器各樣品在NA平板及PDA平板上經(jīng)不同培養(yǎng)條件及不同培養(yǎng)時(shí)間后，平板表面上生長(zhǎng)出的菌落情況。結(jié)果表明，對(duì)照組蒸發(fā)器部分樣品，在平板上生長(zhǎng)一定時(shí)間后，其表面生長(zhǎng)出了部分菌落，其中尤以C1樣品(采自對(duì)照組蒸發(fā)器正面左上角，圖1C1位置)為最。由圖可知，C1樣品無論是經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)或厭氧培養(yǎng)后，其對(duì)應(yīng)的NA平板上均著生有較多數(shù)量的微生物菌落。同時(shí)，上述樣品經(jīng)PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，平板上同樣觀察到大量菌落的生長(zhǎng)。這一結(jié)果表明，未經(jīng)抗菌劑處理的汽車空調(diào)蒸發(fā)器，其表面滋生和繁殖的微生物群落數(shù)量顯著高于經(jīng)抗菌處理后的抗菌組汽車空調(diào)蒸發(fā)器。

圖5 對(duì)照組蒸發(fā)器樣品在NA平板上常規(guī)培養(yǎng)24 h后的菌落生長(zhǎng)情況

圖6 對(duì)照組蒸發(fā)器樣品在NA平板上厭氧培養(yǎng)48 h后的菌落生長(zhǎng)情況

圖7 對(duì)照組蒸發(fā)器樣品在PDA平板上培養(yǎng)7 d后的菌落生長(zhǎng)情況

此外，試驗(yàn)結(jié)果還表明，微生物在該蒸發(fā)器上的滋生及繁殖位置，主要集中于蒸發(fā)器進(jìn)風(fēng)口面左上角位置(對(duì)應(yīng)圖1C1位置)，表現(xiàn)為該處對(duì)應(yīng)樣品上分離得到的菌落數(shù)顯著高于其它部位樣品上分離到的菌落數(shù)，抗菌組蒸發(fā)器中PDA平板上的菌落結(jié)果也驗(yàn)證了該結(jié)果。這一結(jié)果表明，汽車空調(diào)蒸發(fā)器上的微生物群落分布疑與蒸發(fā)器的安裝位置或其進(jìn)風(fēng)口位置密切相關(guān)。

2.2 菌株的純化及顯微形態(tài)觀察

從上述NA或PDA上挑取形態(tài)各異的單菌落，分別轉(zhuǎn)接至另一對(duì)應(yīng)的NA平板或PDA平板上，于37 ℃(NA平板)或28 ℃(PDA平板)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，得到經(jīng)純化后的菌株?？咕M蒸發(fā)器及對(duì)照組蒸發(fā)器樣品分離得到的純化菌株數(shù)如表4所示。

由表4可知，從抗菌組蒸發(fā)器上分離純化得到的菌株數(shù)一共為10株(A1～A10)，而對(duì)照組蒸發(fā)器上經(jīng)分離純化得到的菌株數(shù)為50株(C1～C50)，顯著高于抗菌處理組蒸發(fā)器。這一結(jié)果表明經(jīng)過抗菌處理后，蒸發(fā)器表面的微生物種群數(shù)量大幅降低，表明適宜的抗菌處理可有效抑制汽車空調(diào)蒸發(fā)器上微生物的滋生與繁殖。

表4 蒸發(fā)器樣品分離菌株數(shù)量及編號(hào)

2.3 微生物菌株的形態(tài)鑒定

圖8為抗菌組蒸發(fā)器上分離得到的10株菌株A1-A10在光學(xué)顯微鏡(10×100)下的顯微形態(tài)圖。由圖可知，在A1～A10菌株中，大部分菌株形態(tài)呈桿菌，部分為短桿狀或柱狀，部分呈長(zhǎng)鏈狀排列，顯微視野中可見卵圓形芽孢或碎裂的芽孢殼，可以明確判斷其為芽孢桿菌屬菌株。而A3～A5菌株在顯微形態(tài)下呈卵圓形，部分細(xì)胞可見頂端芽體，根據(jù)其形態(tài)可初步推斷其為酵母菌。

圖8 抗菌組蒸發(fā)器分離菌株(A1～A10)的顯微形態(tài)圖

圖9為對(duì)照組蒸發(fā)器上分離得到的微生物菌株(C1～C50)在光學(xué)顯微鏡下的顯微形態(tài)圖。由圖9可知，C1～C50菌株中大部分菌株的顯微形態(tài)呈短桿狀至柱狀或長(zhǎng)鏈桿狀，且在顯微視野下可見芽孢或芽孢殼，表明C1～C50中的大部分菌株也為芽孢桿菌。此外，部分菌株的顯微形態(tài)呈球狀或球桿狀和細(xì)小桿菌等，根據(jù)顯微形態(tài)難以判斷出其所屬種群，還需結(jié)合其分子生物學(xué)鑒定結(jié)果才能準(zhǔn)確判斷。形態(tài)鑒定結(jié)果也表明，從對(duì)照組中分離得到的微生物菌株，其微生物種群的類別要明顯多于經(jīng)抗菌處理后的抗菌組蒸發(fā)器上的微生物種群，這一結(jié)果證明抗菌處理不僅可以抑制汽車空調(diào)蒸發(fā)器中微生物的種群數(shù)量，也有利于抑制微生物種群中部分特定菌株的生長(zhǎng)和繁殖。

圖9 對(duì)照組蒸發(fā)器分離菌株(C1～C50)的顯微形態(tài)圖

2.4 微生物菌株的分子鑒定

對(duì)上述分離得到的A1～A10及C1～C50號(hào)菌株提取DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序并進(jìn)行BLAST比對(duì)后，再結(jié)合其顯微形態(tài)特征，明確了上述菌株的種屬分類?？咕M蒸發(fā)器及對(duì)照組蒸發(fā)器采樣樣品分離菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果如表5所示。由表5可知，抗菌組蒸發(fā)器上分離得到的10株菌株中，7株為芽孢桿菌，占總菌株數(shù)量的70%，為抗菌組蒸發(fā)器微生物種群中的優(yōu)勢(shì)種群；另三株為紅酵母屬(Rhodotorulasp.)菌株，占總菌株數(shù)量的30%。

表5 不同樣品上分離菌株的鑒定種屬結(jié)果

對(duì)照組蒸發(fā)器分離菌株中，共發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬(Bacillussp.)菌株44株，占總菌數(shù)的88%，表明對(duì)照組蒸發(fā)器微生物種群中的優(yōu)勢(shì)菌株也為芽孢桿菌。這與抗菌組蒸發(fā)器上的優(yōu)勢(shì)菌群相一致，表明汽車空調(diào)微生物種群中的優(yōu)勢(shì)菌群為芽孢桿菌，這與芽孢桿菌自身極強(qiáng)的耐受性密切相關(guān)。研究表明，芽孢桿菌產(chǎn)生的孢子(芽孢)對(duì)諸如高溫、干燥、輻射、酸堿等不利環(huán)境條件均有極強(qiáng)的抵抗力，能在不利的環(huán)境條件中存活，并在適宜條件下重新復(fù)蘇存活。除芽孢桿菌外，對(duì)照組蒸發(fā)器樣品中還分離得到了約翰遜不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjohnsonii)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)和甲基桿菌(Methylobacteriumsp.)幾種菌，均為革蘭氏陰性桿菌。鞘氨醇單胞菌屬和甲基桿菌屬微生物通常是室內(nèi)新風(fēng)空氣凈化系統(tǒng)及室內(nèi)空氣中經(jīng)常檢出的微生物優(yōu)勢(shì)菌群[3,4]。不動(dòng)桿菌屬菌株生存能力極強(qiáng)，對(duì)高磷高鹽、制霉菌素、絲綢染劑、紫外線及多種抗生素類藥物等均有較強(qiáng)抵抗力[5-8]。此外，約翰遜不動(dòng)桿菌還是一種重要的條件致病菌，在一定條件下可引發(fā)呼吸道感染、燒傷感染、中耳炎、腦膜炎、敗血癥和泌尿系統(tǒng)感染等[9]。

3 結(jié)論

微生物污染是引發(fā)汽車空調(diào)異味的主要原因，對(duì)汽車空調(diào)蒸發(fā)器上微生物種群的分析調(diào)查有助于明確污染汽車空調(diào)的主要微生物類群，從而為后續(xù)解決汽車空調(diào)異味提供研究基礎(chǔ)及科學(xué)指導(dǎo)。通過對(duì)抗菌組及對(duì)照組汽車空調(diào)蒸發(fā)器表面樣品的采集、分離及鑒定，共從抗菌組蒸發(fā)器上分離得到10株菌株，從對(duì)照組蒸發(fā)器上分離得到50株菌株。此外，無論在抗菌組還是對(duì)照組蒸發(fā)器中，芽孢桿菌均是汽車空調(diào)蒸發(fā)器微生物種群中的優(yōu)勢(shì)菌群，其次為紅酵母菌及鞘氨醇單胞菌等。與對(duì)照組蒸發(fā)器相比，抗菌組蒸發(fā)器上的微生物群落與種類均顯著下降，表明對(duì)汽車空調(diào)蒸發(fā)器的抗菌處理可有效抑制蒸發(fā)器表面微生物群落的滋生及繁殖。