楊正蓉，李濤，李成良，盧鎮(zhèn)江，宋夢(mèng)強(qiáng)，鄭倩

(1.川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637100；2.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，四川 南充 637100)

0 引言

香葉木素主要從菊花、留蘭香、蜘蛛香等天然藥物和檸檬、柑橘、花生等天然黃酮類化合物果實(shí)中提取的黃酮類化合物[1]。香葉木素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎及抗菌等多種藥理活性[2]。有實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)可保護(hù)小鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷[3]，同時(shí)可保護(hù)視網(wǎng)膜功能，機(jī)制與減少DNA損傷和降低氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[4]。近期有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明香葉木素可通過增加SOD活性和減少M(fèi)DA含量從而對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[5]。目前香葉木素對(duì)耐缺氧和抗疲勞的作用及其機(jī)制的報(bào)道較少，本課題通過不同濃度香葉木素對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，建立低張性缺氧、亞硝酸鈉缺氧、急性腦缺血性缺氧模型，觀察各組小鼠存活時(shí)間，同時(shí)觀察香葉木素對(duì)小鼠負(fù)重游泳和爬桿實(shí)驗(yàn)的時(shí)間變化，并檢測(cè)小鼠肝臟中S0D、MDA的變化，以此探討香葉木素對(duì)耐缺氧和抗疲勞的作用及其相應(yīng)機(jī)制，為開發(fā)香葉木素的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康KM成年小鼠75只，體重為24-28g，全為雄性，小鼠由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)在溫度為26℃的環(huán)境中。普通飼料由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房提供，常溫避光保存。

1.1.2 分組

將小鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組(NOR)、低劑量組香葉木素10mg/(kg·d)、高劑量組香葉木素50mg/(kg·d)，香葉木素組每天16時(shí)給小鼠灌胃，連續(xù) 25d。對(duì)照組灌胃生理鹽水，按體重于每天16時(shí)灌胃0.1mL/kg 生理鹽水，持續(xù)25d。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

試劑 香葉木素(YM190207A03)、總超氧化物歧化酶(TSOD)測(cè)試盒(南京建成，A001-1)，丙二醇(MDA)測(cè)試盒(南京建成，A003-1)，BSA標(biāo)準(zhǔn)品、BCA工作液。

實(shí)驗(yàn)儀器 缺氧瓶、灌胃針、離心管、微孔板、組織研磨器、離心機(jī)、恒溫水浴箱、玻璃棒、水池。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠低張性缺氧實(shí)驗(yàn)

三組小鼠最后一次灌胃30min后，每組隨機(jī)選出5只小鼠分別放進(jìn)盛有5g鈉石灰的廣口瓶中。用凡士林涂抹瓶口周圍，確保廣口瓶的密閉性，隨后觀察小鼠存活狀態(tài)，記錄小鼠死亡時(shí)間(判斷標(biāo)準(zhǔn)：胸口不再起伏)，用此來作為小鼠常壓耐缺氧時(shí)間。

1.3.2 小鼠亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí)驗(yàn)

三組小鼠最后一次灌胃30min后，隨機(jī)選出5只小鼠，各組小鼠腹腔注射5%亞硝酸鈉(0.1mL/10g)，注射后觀察小鼠生存情況直至小鼠呼吸停止，記錄死亡時(shí)間。

1.3.3 急性缺血缺氧實(shí)驗(yàn)(斷頭)

三組小鼠最后一次灌胃30min后，每組隨機(jī)選出5只小鼠，自頸部斷頭，記錄小鼠斷頭后出現(xiàn)張口喘息至停止呼吸的時(shí)間。

1.3.4 小鼠負(fù)重游泳

三組小鼠最后一次灌胃30min后，每組隨機(jī)選出5只小鼠，將小鼠放入水槽，進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn)，水溫(25±2)℃，將自身體重8%鉛絲重物綁的位置在尾部1/3-2/3處，且系重物繩子不能接觸桶底，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程每只小鼠四肢不停運(yùn)動(dòng)，用秒表準(zhǔn)確記錄小鼠力竭游泳時(shí)間，小鼠入水至頭部全部入水持續(xù) 8S內(nèi)不能浮出水面為止表示為力竭游泳時(shí)間。

1.3.5 小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)

三組小鼠最后一次灌胃30min后，每組5只，桿光滑，長(zhǎng)100cm、直徑7mm，垂直懸掛，將經(jīng)訓(xùn)練篩選過的小鼠分別放在玻璃棒上端，記錄小鼠肌肉疲勞乏力而無法抱住玻璃棒上端最終落下的時(shí)間，反復(fù)3次。

1.3.6 小鼠肝臟SOD活性和MDA含量測(cè)定

小鼠低張性缺氧死亡后迅速解剖并制備肝臟勻漿。方法為取出小鼠肝臟，稱重0.2g，用移液管盛入9倍的0.9%的Nacl溶液，將剪碎的肝臟組織放入到離心管中，用研磨槍充分研磨直至成勻漿，濃度為10%，勻漿離心10min (3000r/min)，取上清液分裝待用。根據(jù)SOD試劑盒說明書和MDA試劑盒說明書操作和計(jì)算[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度香葉木素對(duì)小鼠低張性缺氧模型的影響

結(jié)果如表1，給予小鼠香葉木素灌胃25天后，與NOR相比較，香葉木素低劑量小鼠存活時(shí)間由(7.34±0.21) min增加(10.78±0.45) min，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高劑量組亦明顯延長(zhǎng)小鼠低張性缺氧存活時(shí)間(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 香葉木素對(duì)小鼠低張性缺氧、亞硝酸鈉和急性缺血缺氧的影響(±s，min)

表1 香葉木素對(duì)小鼠低張性缺氧、亞硝酸鈉和急性缺血缺氧的影響(±s，min)

注：與NOR 比較P<0.05，#P>0.05。

組別 低張性缺氧存活時(shí)間 亞硝酸鈉中毒性缺氧存活時(shí)間 急性缺血缺氧實(shí)驗(yàn)NOR 7.34±0.21 24.73±1.64 19.30±0.62低劑量香葉木素組 10.78±0.45* 25.02± 2.37# 26.72+3.02*高劑量香葉木素組 12.04±1.03* 30.35± 2.51* 30.42+2.28*

2.2 不同濃度香葉木素對(duì)小鼠亞硝酸鈉中毒性缺氧的影響

與正常組比較，香葉木素低劑量組能延長(zhǎng)小鼠亞硝酸中毒缺氧耐受的時(shí)間，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組能延長(zhǎng)存活時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表1。

2.3 香葉木素對(duì)小鼠急性缺血缺氧的影響

結(jié)果見表1，高、低劑量香葉木素組小鼠急性缺血缺氧存活時(shí)間與NOR組相比顯著增加，小鼠斷頭后張口呼吸時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，說明香葉木素能提高小鼠急性缺血缺氧的存活時(shí)間。

2.4 不同濃度香葉木素對(duì)小鼠負(fù)重游泳的影響

給予小鼠灌胃香葉木素 25天后，高，低劑量香葉木素兩組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間與NOR組明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果見表2，低劑量香葉木素組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間由(96.4±13.50) s增加至(328.25±18.03) s，提高率為70.63%；高劑量香葉木素組負(fù)重游泳時(shí)間(96.4±13.50) s增加至(423.65±30.26) s，提高率為77.24%。

2.5 不同濃度香葉木素對(duì)小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)的影響

給予小鼠灌胃香葉木素 25天后(結(jié)果見表2)，與正常組比較，低劑量香葉木素組爬桿時(shí)間明顯延長(zhǎng)，由(74±8.48) s增加到(102.52±12.05) s，P<0.05；高劑量組增加到(386.16±24.22) s，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 香葉木素對(duì)小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)和負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)的影響(±s，s)

表2 香葉木素對(duì)小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)和負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)的影響(±s，s)

注：*與NOR 比較P<0.05，※P<0.01。

組別 爬桿時(shí)間 游泳時(shí)間NOR 74±8.48 96.4±13.50低劑量香葉木素組 102.52±12.05* 328.25±18.03※高劑量香葉木素組 386.16±24.22※ 423.65±30.26※

2.6 不同濃度香葉木素對(duì)各組小鼠肝組織勻漿中MDA含量和 SOD活性的影響

如表3所示高、低劑量香葉木素組小鼠肝臟勻漿MDA含量明顯減少，NOR組小鼠肝臟中的MDA含量高于高、低劑量香葉木素組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NOR組小鼠肝臟的SOD活性相比，高、低濃度香葉木素組明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義P<0.05。

表3 不同濃度香葉木素對(duì)小鼠肝臟SOD活性、MDA的影響(±s)

表3 不同濃度香葉木素對(duì)小鼠肝臟SOD活性、MDA的影響(±s)

注：SOD:超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛，*P<0.05, 與NOR比較。

組別 例數(shù)SOD活性(μ/mL) MDA(nmol/L)NOR 5 156.21±10.06 5.92±1.26低劑量香葉木素組 5 202.53±18.12* 3.36±0.06*高劑量香葉木素組 5 265.04±20.03* 2.92±0.08*

3 討論

缺氧是因組織氧氣供應(yīng)不足或者利用氧氣出現(xiàn)障礙而產(chǎn)生組織代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的病理過程，嚴(yán)重缺氧會(huì)引起心和腦等重要器官的不可逆的損傷，最終導(dǎo)致機(jī)體死亡[7]。本實(shí)驗(yàn)采用低張性缺氧、亞硝酸鈉中毒性缺氧以及急性腦缺氧實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察香葉木素對(duì)缺氧耐受的影響，低張性缺氧為非特異性缺氧，亞硝酸鈉中毒屬于組織細(xì)胞外液缺氧，亞硝酸鈉可使血紅蛋白中二價(jià)鐵氧化為三價(jià)鐵，變成高鐵血紅蛋白，從而失去攜帶氧氣的能力，引起組織細(xì)胞缺氧。在急性腦缺血缺氧試驗(yàn)中，由于腦組織缺乏血液供應(yīng)，呼吸只能利用自身存儲(chǔ)氧氣短暫維持，從而表現(xiàn)為張嘴喘氣。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與NOR組比較，香葉木素低劑量組和高劑量組可以明顯延長(zhǎng)低張性缺氧、亞硝酸鈉中毒性缺氧以及急性缺氧條件下小鼠存活時(shí)間，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明其對(duì)心臟和腦缺氧具有改善作用，并提高心腦組織對(duì)缺氧的耐受。

疲勞是機(jī)體由于長(zhǎng)時(shí)間或過于繁重的腦力和體力勞動(dòng)而引起的工作效率暫時(shí)降低的一種生理心理現(xiàn)象[8]，運(yùn)動(dòng)性疲勞是由機(jī)體一系列生化改變導(dǎo)致的肌肉收縮力降低而產(chǎn)生的，是最直接和最客觀的機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力的降低表現(xiàn)[]，力竭游泳和爬桿時(shí)間一直以來被作為反映運(yùn)動(dòng)性疲勞的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示香葉木素組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；香葉木素組爬桿時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明其有顯著的抗疲勞作用。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺氧可改變機(jī)體氧自由基代謝，主要表現(xiàn)為抗氧化能力下降和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)。SOD是機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用清除氧自由基的酶，可以直接反映機(jī)體抗氧化水平，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切[10]。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其可以間接反映機(jī)體抗氧化能力及清除氧化產(chǎn)物的能力[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示結(jié)果顯示香葉木素組提高小鼠肝臟中SOD的活性(P<0.05)，小鼠肝臟MDA含量明顯減少(P<0.05)，結(jié)果顯示香葉木素能增強(qiáng)肝臟內(nèi)SOD的活性，降低MDA含量，從而減輕損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明香葉木素有良好的缺氧耐受和抗疲勞作用，其作用機(jī)制與抗氧化有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)為香葉木素的開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。