呂佳斌,翁啟杰,李發(fā)根,李 梅,李昌榮,陳健波,陳劍成,甘四明,
(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所,熱帶林業(yè)研究國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510520;2.南京林業(yè)大學(xué),江蘇 南京 210037;3.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 a.廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b.中南速生材繁育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530002;4.玉林市林業(yè)科學(xué)研究所,廣西 容縣 537501)
分子標(biāo)記技術(shù)為父本鑒定提供了快捷有效的工具。其中,簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple sequence repeat,SSR,又稱微衛(wèi)星)標(biāo)記是基于2~6 個(gè)堿基單元、通過(guò)重復(fù)數(shù)量的變異而形成DNA 片段長(zhǎng)度的多態(tài)性[6-7]。其具有共顯性、基因組中分布廣泛、多態(tài)性高、重復(fù)性好和檢測(cè)方法靈活等優(yōu)點(diǎn)[8],已廣泛用于群體遺傳多樣性分析[9]、核心種質(zhì)構(gòu)建[10]、品種指紋圖譜構(gòu)建[11]、親子關(guān)系鑒定[10]及譜系分析和標(biāo)記輔助育種[13]等研究。目前,利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)已在尾葉桉[4]、巨桉Eucalyptus grandisHill ex Maiden[14]、藍(lán)灰麻利Eucalyptus caesiaBenth.[15]、美洲黑楊Populusdeltoides(Bartr.)Marsh.[16]、木荷Schima superbaGardn.et Champ.[17]、馬尾松Pinus massonianaLamb.[18]、日本落葉松Larix kaempferi(Lamb.) Carr.[19]和西美落葉松[5]等樹種中進(jìn)行了全同胞子代的父本鑒定。此外,Brondani 等[20]、He 等[21]和Zhou 等[22]已經(jīng)開發(fā)了桉屬EucalyptusL’Hérit.樹種(簡(jiǎn)稱桉樹)的大量SSR 標(biāo)記,為桉樹子代的父本鑒定提供了豐富的標(biāo)記資源。
大花序桉Eucalyptus cloezianaF.Muell.是桉屬昆士蘭桉亞屬IdiogenesL.D.Pryor &L.A.S.Johnson ex Brooker 的唯一樹種[23]。其木材硬度高、結(jié)構(gòu)均勻、紋理通直且沉重耐久,是優(yōu)良的實(shí)木用材樹種,廣泛用于建筑、家具、坑木和礦柱等[24]。本研究利用前期優(yōu)化的12 個(gè)可多重檢測(cè)的SSR 標(biāo)記,對(duì)1 株母本自由授粉的2 184 株子代苗進(jìn)行了父本鑒定,旨在為基于全同胞子代群體的遺傳分析提供基礎(chǔ)材料。
從14年生的大花序桉種源/家系試驗(yàn)林中采集優(yōu)樹5-018 的蒴果,晾曬后獲得種子。該試驗(yàn)林于2004年5月建立,位于廣西壯族自治區(qū)玉林市林業(yè)科學(xué)研究所(110°09′E,22°39′N),包括17 個(gè)種源115 個(gè)家系,該試驗(yàn)地為亞熱帶季風(fēng)氣候,年平均降水量為1 582 mm,年平均氣溫為21.8℃,并沿等高線方向以隨機(jī)整塊形式進(jìn)行排列,行間距為2.0 m×3.5 m[25]。2018年11月初利用獲得的種子在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所苗圃育苗,于2018年12月中旬移植到營(yíng)養(yǎng)袋中,2019年4月底采集幼苗嫩葉并于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?,共?jì)2 184 株;同時(shí),利用卷尺測(cè)量苗期株高。此外,試驗(yàn)林保留的其他706 株大樹作為候選父本,已經(jīng)開展了SSR 標(biāo)記實(shí)驗(yàn),具體見前期報(bào)道[26]。
嫩葉DNA 提取采用新型植物基因組DNA 提取試劑盒(深圳市艾偉迪生物科技有限公司),具體操作參照廠家提供的說(shuō)明書,所得DNA 采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性,利用NanoDrop 2000(美國(guó)Thermo Scientific)測(cè)定DNA 的濃度和純度,并稀釋至5 ng/μL 備用,存放于-20℃冰箱備用。
利用Brondani 等[20]、He 等[21]和Zhou 等[22]前期報(bào)道的12 個(gè)SSR 標(biāo)記(表1),包括4 個(gè)前綴為EMBRA 的基因組SSRs[20]和8 個(gè)前綴為EUCeSSR 的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tag,EST)SSRs[21-22],SSR 引物送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成,前向引物5′端進(jìn)行HEX、6-FAM、ROX 或TAM 熒光修飾?;谇捌趦?yōu)化的多重檢測(cè)體系[26],對(duì)所有樣品進(jìn)行分型檢測(cè)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)體系為10 μL,包括1.0 μL 10×buffer(100 mM Tris-HCl pH 9.0、100 mM KCl、80 mM (NH4)2SO4、0.5% NP-40 和20 mM MgCl2)、200 μM dNTP、正向和反向引物各0.13~0.50 μM[26]、1 U Taq DNA 聚合酶(上海博樂(lè)生物技術(shù)有限公司)和5 ng DNA。PCR 程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,56、58 或者60℃退火30 s,72℃延伸50 s,35 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。特別地,EMBRA332 標(biāo)記采用降落PCR 程序:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,60~70℃退火30 s、每個(gè)循環(huán)降低0.5℃,72℃延伸50 s,21 個(gè)循環(huán);94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸50 s,25個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。
表1 參試12 個(gè)SSR 標(biāo)記及其多樣性參數(shù)?Table 1 Twelve SSR markers included and their polymorphism parameters
PCR 產(chǎn)物(0.25~1.0 mL)[26]加入9.34 μL超純甲酰胺和0.16 μL GeneScan 500 LIZ 內(nèi)標(biāo)(美國(guó)Applied Biosystems)稀釋,經(jīng)95℃變性5 min,迅速冰上冷卻。SSR 標(biāo)記在ABI 3130xl 遺傳分析儀(Applied Biosystems)上進(jìn)行分型,參照測(cè)序儀操作手冊(cè),利用軟件GeneMapper 4.1(Applied Biosystems)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。
桉屬樹種一般為二倍體[27],即一個(gè)子代在某個(gè)SSR 標(biāo)記上最多有兩條等位片段,一條來(lái)自母本、另一條來(lái)自父本。在本研究中,母本為已知的優(yōu)樹5-018,則需要鑒定的是單個(gè)子代中非母本的等位片段可能的父本來(lái)源。利用軟件CERVUS 3.0[28]和已知母本的模型[12],基于最大似然法估算概率的對(duì)數(shù)(Logarithm of odds,LOD),設(shè)置10 000次模擬循環(huán),候選父本取樣比例和不匹配的標(biāo)記位點(diǎn)比率分別設(shè)為0.8 和0.01,其中,LOD 值為負(fù),則表明雄性樣品為隨機(jī)樣本,并非測(cè)試的真實(shí)父本,LOD 值為正,則表明雄性樣品是檢測(cè)子代的真實(shí)父本的可能性大于隨機(jī)樣品,LOD 值越大,為真實(shí)父本的可能性也越大[29]。具有最大LOD 值的候選父本即為真實(shí)父本,同一父本的所有子代即為全同胞子代(或稱全同胞家系)。
基于軟件Joinmap 4[30-31]中的“CP”(Cross pollinator)模型要求,利用軟件Excel 2013 將各標(biāo)記的等位片段長(zhǎng)度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)編碼,無(wú)擴(kuò)增或擴(kuò)增不清晰的標(biāo)記記為“-”。該模型考慮了共顯性標(biāo)記的所有親本組合類型,避免將F1群體的標(biāo)記數(shù)據(jù)按照擬測(cè)交的策略只進(jìn)行1∶1 分離類型的計(jì)算,提高了分離類型檢測(cè)的有效性[32]。利用Joinmap 4[30-31]對(duì)所有標(biāo)記進(jìn)行孟德爾期望分離比的檢測(cè),方法為卡方檢驗(yàn)。
利用軟件GenAlEx v6.5[33-34]計(jì)算等位片段數(shù)(Number of alleles,Na)、有效等位片段數(shù)(Number of effective alleles,Ne)和等位片段范圍(allelic size range,ASR)等位點(diǎn)參數(shù)。利用軟件CERVUS 3.0[28]計(jì)算觀測(cè)雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)和多態(tài)性信息量(Polymorphic information content,PIC)等多樣性參數(shù)。
為避免人造金紅石產(chǎn)品發(fā)生粉化,20世紀(jì)80年代,長(zhǎng)沙礦冶研究院對(duì)原有工藝進(jìn)行改進(jìn),自主研發(fā)了預(yù)氧化- 流態(tài)化常壓浸出工藝[6]。該工藝是將鈦鐵礦在回轉(zhuǎn)窯中進(jìn)行低溫(750 ℃左右)預(yù)氧化焙燒,使其顆粒表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,并生成FeTiO3-Fe2O3固溶體和金紅石微晶,冷卻后加入流態(tài)化浸出塔中,用稀鹽酸三段逆流浸出,再經(jīng)洗滌、過(guò)濾和煅燒制得人造金紅石。并于1982年在重慶天原化工廠建設(shè)了5 000 t/a中試線[7]。其關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)在于采用適度氧化焙燒與流態(tài)化浸出設(shè)備多段浸出相結(jié)合,有效解決了酸浸過(guò)程中的粉化問(wèn)題,但仍未實(shí)現(xiàn)鹽酸的再生和循環(huán)使用。
利用軟件Excel 2013 進(jìn)行全同胞家系苗高均值和變異系數(shù)的計(jì)算。利用軟件SPSS 進(jìn)行t檢驗(yàn)以檢測(cè)近交家系與異交家系的多樣性參數(shù)是否存在差異顯著(P≤0.01),并計(jì)算全同胞家系Ho和He與苗高均值和變異系數(shù)的Pearson 相關(guān)系數(shù)。
12 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)優(yōu)樹5-018 的自由授粉子代均能有效擴(kuò)增和分型檢測(cè),圖1顯示了標(biāo)記EUCeSSR345 對(duì)母本5-018、候選父本16-057 和8株子代的等位片段分型結(jié)果。表1列出了標(biāo)記的多樣性參數(shù),共獲得138 個(gè)等位片段,其中,單個(gè)標(biāo)記的Na最低為4,最高為15,平均為7.9;Ne最低為1.03,最高為2.20,平均為1.70;Ho最低為0.035,最高為0.682,平均為0.386;He最低為0.035,最高為0.547,平均為0.364;PIC最低為0.034,最高為0.444,平均為0.298。
圖1 標(biāo)記EUCeSSR345 對(duì)母本、候選父本和8 株子代的分型檢測(cè)Fig.1 Allelic genotyping with EUCeSSR345 against maternal and candidate paternal parents as well as eight sibs
優(yōu)樹5-018 的2 184 株自由授粉子代中,1 697株明確了父本來(lái)源(表2),鑒定率為77.7%,而487 株因LOD 較低或者位點(diǎn)缺失較多,不能確定父本,占22.3%。其中子代130 株以上的主要父本有6 個(gè),包括10-039、5-021、16-057、50-293、16-059 和5-017,單個(gè)父本的子代數(shù)量為138~395 個(gè)。其中,5-021 和5-017 與母本5-018來(lái)自同一個(gè)半同胞家系,其子代為近交子代,相應(yīng)全同胞家系為近交家系。此外,父本107-646 有19 株子代,另外131 個(gè)父本共產(chǎn)生了244 株子代、單個(gè)父本的子代數(shù)量為1~9 株(數(shù)據(jù)未列示)。同時(shí),為進(jìn)一步驗(yàn)證大花序桉種子園的自交情況,也將5-018 作為父本進(jìn)行了分析,未發(fā)現(xiàn)母本的自交子代,表明大花序桉自交的可能性極低。
表2 鑒定的父本和子代數(shù)量及全同胞家系的多樣性參數(shù)和平均苗高?Table 2 Paternal parents,their sib numbers,and full-sib family derived heterozygosity and seedling mean height
基于試驗(yàn)林種植圖的父本與母本的距離,分析大花序桉花粉散布規(guī)律,可推測(cè)花粉傳播的距離。圖2顯示了父本的距離及其子代數(shù)量,可見大花序桉花粉散布的距離較遠(yuǎn),可達(dá)160 m,但主要范圍在100 m,在此距離范圍內(nèi),共產(chǎn)生了1 436 株子代,占已確定父本子代數(shù)量的84.6%,而在100~160 m 內(nèi)僅277 株子代,占15.4%,這進(jìn)一步表明100 m 之外大花序桉父本仍然可以為母本提供花粉,但隨著距離的增加、產(chǎn)生子代的數(shù)量明顯減少。特別地,父本16-059 距離母樹達(dá)135 m,但全同胞子代數(shù)量仍有155 株,圖1也顯示了標(biāo)記EUCeSSR345 對(duì)父本16-057 的3 株子代和5 株非親子代的分型結(jié)果。
圖2 父本與母本的距離及子代數(shù)量Fig.2 Parental distance and number of full-sibs
對(duì)子代數(shù)量10株以上的7個(gè)全同胞家系(表3)的12 個(gè)標(biāo)記進(jìn)行卡方檢驗(yàn),結(jié)果表明,各標(biāo)記在不同家系中均存在不同程度的偏離期望的孟德爾分離比例,每個(gè)家系偏分離標(biāo)記的數(shù)量從2~9個(gè)不等(P≤0.05),平均為6.1 個(gè)。父本10-039的全同胞家系中,標(biāo)記EMBRA8 的χ2值高達(dá)308.62,嚴(yán)重偏分離。此外,標(biāo)記EUCeSSR444、EUCeSSR0256、EUCeSSR241 和EUCeSSR1116 標(biāo)記在多個(gè)全同胞家系中均存在無(wú)分離類型的現(xiàn)象。
表3 SSR 標(biāo)記在相應(yīng)父本的全同胞家系中分離比的卡方檢驗(yàn)?Table 3 χ2 test for marker segregation within each full-sib family with paternal parent identified
對(duì)于子代數(shù)量10 株以上的7 個(gè)全同胞家系(表2),多樣性參數(shù)均較低,如Ho為0.316~0.472、He為0.258~0.340,雜合度最高的家系是父本為5-017 的近交家系。t檢驗(yàn)也表明,異交家系與近交家系的Ho(t=0.227,P=0.822)和He(t=0.139,P=0.891)均無(wú)顯著差別。
這7 個(gè)全同胞家系4月生苗高的平均為18.21~33.96 cm,變異系數(shù)介于0.34~4.54%(表2)。Ho和He與平均苗高的相關(guān)系數(shù)分別為–0.173(P=0.710)和–0.194(P=0.677),與苗高變異系數(shù)的相關(guān)系數(shù)分別為–0.226(P=0.626)和–0.232(P=0.617),均無(wú)顯著相關(guān)性。
本研究對(duì)大花序桉1 株母本的2 184 株自由授粉子代進(jìn)行了父本鑒定,共有1 697 株(77.7%)子代確定了父本(花粉)來(lái)源。鑒定的比例高于木荷[17](61.9%)和馬尾松[18](72.5%),但低于美洲黑楊[16](97.9%)、藍(lán)灰麻利[15](92.4%)和日本落葉松[19](93.7%)。父本鑒定的子代比例與多種因素有關(guān),如引物數(shù)量與多態(tài)性、外來(lái)花粉污染和候選父本數(shù)量等。一般認(rèn)為,3~6 個(gè)共顯性標(biāo)記足以進(jìn)行異交群體的分型鑒定[35-36],本研究所用的12個(gè)共顯性SSR標(biāo)記在數(shù)量上是足夠的,也具有較高的多態(tài)性[26],子代鑒定的有效性應(yīng)較高。大花序桉為昆士蘭桉亞屬唯一種,不會(huì)與其他種雜交,將采集的試驗(yàn)林附近的桉樹人工林和行道樹(主要是無(wú)性系DH32-29 和廣9)20 株納入分析、也未發(fā)現(xiàn)有授粉(數(shù)據(jù)未列示),并且試驗(yàn)林周圍沒(méi)有其他大花序桉林分,因此不存在外來(lái)花粉污染的可能性。候選父本數(shù)量上,一般認(rèn)為超過(guò)100 時(shí)父本產(chǎn)生相同配子基因型的概率較高[37]而降低鑒定的有效性。本研究707 株候選父本且LOD 閾值較高,這在一定程度上影響了鑒定的子代比例;更為重要的是,大花序桉的蒴果可在母樹上留存3年,少數(shù)授粉父本可能在取樣時(shí)因多種原因死亡,因此無(wú)從追查父本來(lái)源,從而降低了鑒定比例。
SSR 位點(diǎn)變異也可能影響鑒定的有效性。在親子遺傳中,少數(shù)子代存在SSR 重復(fù)單元數(shù)的增減而產(chǎn)生非親等位片段的現(xiàn)象[38-39],影響鑒定的準(zhǔn)確性。例如,Moriya 等[40]發(fā)現(xiàn)蘋果Malus×domesticaBorkh.子代SSR 突變是因?yàn)镾SR 重復(fù)單元數(shù)的增加,而兩端的序列(包括引物結(jié)合序列)沒(méi)有發(fā)生變化。
等位基因的偏分離作為生物進(jìn)化的動(dòng)力之一[41],可以增加群體中雜合等位基因或者異型染色體的頻率,是生物界普遍存在的一種現(xiàn)象,特別是共顯性標(biāo)記。目前,造成偏分離的原因尚不清晰,一般認(rèn)為造成偏分離的原因與遺傳分離機(jī)制[42]、染色體缺失[43]、花粉選擇以及隱性致死等位基因遺傳負(fù)荷表達(dá)[44]等一系列因素有關(guān),以上幾種造成基因偏分離現(xiàn)象的出現(xiàn)均是由于染色體的某些位置的重組率下降或者不發(fā)生重組造成的[45]。
大花序桉的授粉并非隨機(jī)的,而是遵從較近距離花粉優(yōu)先的原則[46],散布范圍主要集中在100 m 以內(nèi)。隨著父本與母本距離的增大,授粉率逐漸降低,這與花粉流的強(qiáng)度隨父本距離增加而降低有關(guān)[47]。這也與Chaix 等[14],Bezemer 等[15]和Eldridge 等[48]報(bào)道的桉樹研究結(jié)果相似。
本研究利用前期優(yōu)化的12 個(gè)可多重檢測(cè)的SSR 標(biāo)記,對(duì)大花序桉1 株母本的2 184 株自由授粉子代進(jìn)行了父本鑒定,獲得了6 個(gè)130 株以上的全同胞家系,本研究的結(jié)果可以為大花序桉進(jìn)一步分析研究奠定材料基礎(chǔ),如遺傳資源測(cè)定、遺傳圖譜構(gòu)建和數(shù)量性狀位點(diǎn)定位等研究。