呂佳斌，翁啟杰，李發(fā)根，李 梅，李昌榮，陳健波，陳劍成，甘四明，

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，熱帶林業(yè)研究國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510520；2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037；3.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 a.廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.中南速生材繁育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530002；4.玉林市林業(yè)科學(xué)研究所，廣西 容縣 537501）

分子標(biāo)記技術(shù)為父本鑒定提供了快捷有效的工具。其中，簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeat,SSR，又稱微衛(wèi)星）標(biāo)記是基于2～6 個(gè)堿基單元、通過(guò)重復(fù)數(shù)量的變異而形成DNA 片段長(zhǎng)度的多態(tài)性[6-7]。其具有共顯性、基因組中分布廣泛、多態(tài)性高、重復(fù)性好和檢測(cè)方法靈活等優(yōu)點(diǎn)[8]，已廣泛用于群體遺傳多樣性分析[9]、核心種質(zhì)構(gòu)建[10]、品種指紋圖譜構(gòu)建[11]、親子關(guān)系鑒定[10]及譜系分析和標(biāo)記輔助育種[13]等研究。目前，利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)已在尾葉桉[4]、巨桉Eucalyptus grandisHill ex Maiden[14]、藍(lán)灰麻利Eucalyptus caesiaBenth.[15]、美洲黑楊Populusdeltoides(Bartr.)Marsh.[16]、木荷Schima superbaGardn.et Champ.[17]、馬尾松Pinus massonianaLamb.[18]、日本落葉松Larix kaempferi(Lamb.) Carr.[19]和西美落葉松[5]等樹種中進(jìn)行了全同胞子代的父本鑒定。此外，Brondani 等[20]、He 等[21]和Zhou 等[22]已經(jīng)開發(fā)了桉屬EucalyptusL’Hérit.樹種（簡(jiǎn)稱桉樹）的大量SSR 標(biāo)記，為桉樹子代的父本鑒定提供了豐富的標(biāo)記資源。

大花序桉Eucalyptus cloezianaF.Muell.是桉屬昆士蘭桉亞屬IdiogenesL.D.Pryor &L.A.S.Johnson ex Brooker 的唯一樹種[23]。其木材硬度高、結(jié)構(gòu)均勻、紋理通直且沉重耐久，是優(yōu)良的實(shí)木用材樹種，廣泛用于建筑、家具、坑木和礦柱等[24]。本研究利用前期優(yōu)化的12 個(gè)可多重檢測(cè)的SSR 標(biāo)記，對(duì)1 株母本自由授粉的2 184 株子代苗進(jìn)行了父本鑒定，旨在為基于全同胞子代群體的遺傳分析提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 植物材料和DNA 提取

從14年生的大花序桉種源/家系試驗(yàn)林中采集優(yōu)樹5-018 的蒴果，晾曬后獲得種子。該試驗(yàn)林于2004年5月建立，位于廣西壯族自治區(qū)玉林市林業(yè)科學(xué)研究所（110°09′E，22°39′N），包括17 個(gè)種源115 個(gè)家系，該試驗(yàn)地為亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均降水量為1 582 mm，年平均氣溫為21.8℃，并沿等高線方向以隨機(jī)整塊形式進(jìn)行排列，行間距為2.0 m×3.5 m[25]。2018年11月初利用獲得的種子在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所苗圃育苗，于2018年12月中旬移植到營(yíng)養(yǎng)袋中，2019年4月底采集幼苗嫩葉并于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?，共?jì)2 184 株；同時(shí)，利用卷尺測(cè)量苗期株高。此外，試驗(yàn)林保留的其他706 株大樹作為候選父本，已經(jīng)開展了SSR 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，具體見前期報(bào)道[26]。

嫩葉DNA 提取采用新型植物基因組DNA 提取試劑盒（深圳市艾偉迪生物科技有限公司），具體操作參照廠家提供的說(shuō)明書，所得DNA 采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，利用NanoDrop 2000（美國(guó)Thermo Scientific）測(cè)定DNA 的濃度和純度，并稀釋至5 ng/μL 備用，存放于-20℃冰箱備用。

1.2 SSR-PCR 多重?cái)U(kuò)增及毛細(xì)管電泳檢測(cè)

利用Brondani 等[20]、He 等[21]和Zhou 等[22]前期報(bào)道的12 個(gè)SSR 標(biāo)記（表1），包括4 個(gè)前綴為EMBRA 的基因組SSRs[20]和8 個(gè)前綴為EUCeSSR 的表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）SSRs[21-22]，SSR 引物送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，前向引物5′端進(jìn)行HEX、6-FAM、ROX 或TAM 熒光修飾?；谇捌趦?yōu)化的多重檢測(cè)體系[26]，對(duì)所有樣品進(jìn)行分型檢測(cè)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）體系為10 μL，包括1.0 μL 10×buffer（100 mM Tris-HCl pH 9.0、100 mM KCl、80 mM (NH4)2SO4、0.5% NP-40 和20 mM MgCl2）、200 μM dNTP、正向和反向引物各0.13～0.50 μM[26]、1 U Taq DNA 聚合酶（上海博樂(lè)生物技術(shù)有限公司）和5 ng DNA。PCR 程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，56、58 或者60℃退火30 s，72℃延伸50 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。特別地，EMBRA332 標(biāo)記采用降落PCR 程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，60～70℃退火30 s、每個(gè)循環(huán)降低0.5℃，72℃延伸50 s，21 個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸50 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

表1 參試12 個(gè)SSR 標(biāo)記及其多樣性參數(shù)?Table 1 Twelve SSR markers included and their polymorphism parameters

PCR 產(chǎn)物（0.25～1.0 mL）[26]加入9.34 μL超純甲酰胺和0.16 μL GeneScan 500 LIZ 內(nèi)標(biāo)（美國(guó)Applied Biosystems）稀釋，經(jīng)95℃變性5 min，迅速冰上冷卻。SSR 標(biāo)記在ABI 3130xl 遺傳分析儀（Applied Biosystems）上進(jìn)行分型，參照測(cè)序儀操作手冊(cè)，利用軟件GeneMapper 4.1（Applied Biosystems）進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

1.3 數(shù)據(jù)分析

桉屬樹種一般為二倍體[27]，即一個(gè)子代在某個(gè)SSR 標(biāo)記上最多有兩條等位片段，一條來(lái)自母本、另一條來(lái)自父本。在本研究中，母本為已知的優(yōu)樹5-018，則需要鑒定的是單個(gè)子代中非母本的等位片段可能的父本來(lái)源。利用軟件CERVUS 3.0[28]和已知母本的模型[12]，基于最大似然法估算概率的對(duì)數(shù)（Logarithm of odds，LOD），設(shè)置10 000次模擬循環(huán)，候選父本取樣比例和不匹配的標(biāo)記位點(diǎn)比率分別設(shè)為0.8 和0.01，其中，LOD 值為負(fù)，則表明雄性樣品為隨機(jī)樣本，并非測(cè)試的真實(shí)父本，LOD 值為正，則表明雄性樣品是檢測(cè)子代的真實(shí)父本的可能性大于隨機(jī)樣品，LOD 值越大，為真實(shí)父本的可能性也越大[29]。具有最大LOD 值的候選父本即為真實(shí)父本，同一父本的所有子代即為全同胞子代（或稱全同胞家系）。

基于軟件Joinmap 4[30-31]中的“CP”（Cross pollinator）模型要求，利用軟件Excel 2013 將各標(biāo)記的等位片段長(zhǎng)度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)編碼，無(wú)擴(kuò)增或擴(kuò)增不清晰的標(biāo)記記為“-”。該模型考慮了共顯性標(biāo)記的所有親本組合類型，避免將F1群體的標(biāo)記數(shù)據(jù)按照擬測(cè)交的策略只進(jìn)行1∶1 分離類型的計(jì)算，提高了分離類型檢測(cè)的有效性[32]。利用Joinmap 4[30-31]對(duì)所有標(biāo)記進(jìn)行孟德爾期望分離比的檢測(cè)，方法為卡方檢驗(yàn)。

利用軟件GenAlEx v6.5[33-34]計(jì)算等位片段數(shù)（Number of alleles，Na）、有效等位片段數(shù)（Number of effective alleles，Ne）和等位片段范圍（allelic size range，ASR）等位點(diǎn)參數(shù)。利用軟件CERVUS 3.0[28]計(jì)算觀測(cè)雜合度（Observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity，He）和多態(tài)性信息量（Polymorphic information content，PIC）等多樣性參數(shù)。

為避免人造金紅石產(chǎn)品發(fā)生粉化，20世紀(jì)80年代，長(zhǎng)沙礦冶研究院對(duì)原有工藝進(jìn)行改進(jìn)，自主研發(fā)了預(yù)氧化- 流態(tài)化常壓浸出工藝[6]。該工藝是將鈦鐵礦在回轉(zhuǎn)窯中進(jìn)行低溫(750 ℃左右)預(yù)氧化焙燒，使其顆粒表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并生成FeTiO3-Fe2O3固溶體和金紅石微晶，冷卻后加入流態(tài)化浸出塔中，用稀鹽酸三段逆流浸出，再經(jīng)洗滌、過(guò)濾和煅燒制得人造金紅石。并于1982年在重慶天原化工廠建設(shè)了5 000 t/a中試線[7]。其關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)在于采用適度氧化焙燒與流態(tài)化浸出設(shè)備多段浸出相結(jié)合，有效解決了酸浸過(guò)程中的粉化問(wèn)題，但仍未實(shí)現(xiàn)鹽酸的再生和循環(huán)使用。

利用軟件Excel 2013 進(jìn)行全同胞家系苗高均值和變異系數(shù)的計(jì)算。利用軟件SPSS 進(jìn)行t檢驗(yàn)以檢測(cè)近交家系與異交家系的多樣性參數(shù)是否存在差異顯著（P≤0.01），并計(jì)算全同胞家系Ho和He與苗高均值和變異系數(shù)的Pearson 相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 標(biāo)記的有效擴(kuò)增和多樣性參數(shù)

12 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)優(yōu)樹5-018 的自由授粉子代均能有效擴(kuò)增和分型檢測(cè)，圖1顯示了標(biāo)記EUCeSSR345 對(duì)母本5-018、候選父本16-057 和8株子代的等位片段分型結(jié)果。表1列出了標(biāo)記的多樣性參數(shù)，共獲得138 個(gè)等位片段，其中，單個(gè)標(biāo)記的Na最低為4，最高為15，平均為7.9；Ne最低為1.03，最高為2.20，平均為1.70；Ho最低為0.035，最高為0.682，平均為0.386；He最低為0.035，最高為0.547，平均為0.364；PIC最低為0.034，最高為0.444，平均為0.298。

圖1 標(biāo)記EUCeSSR345 對(duì)母本、候選父本和8 株子代的分型檢測(cè)Fig.1 Allelic genotyping with EUCeSSR345 against maternal and candidate paternal parents as well as eight sibs

2.2 父本鑒定

優(yōu)樹5-018 的2 184 株自由授粉子代中，1 697株明確了父本來(lái)源（表2），鑒定率為77.7%，而487 株因LOD 較低或者位點(diǎn)缺失較多，不能確定父本，占22.3%。其中子代130 株以上的主要父本有6 個(gè)，包括10-039、5-021、16-057、50-293、16-059 和5-017，單個(gè)父本的子代數(shù)量為138～395 個(gè)。其中，5-021 和5-017 與母本5-018來(lái)自同一個(gè)半同胞家系，其子代為近交子代，相應(yīng)全同胞家系為近交家系。此外，父本107-646 有19 株子代，另外131 個(gè)父本共產(chǎn)生了244 株子代、單個(gè)父本的子代數(shù)量為1～9 株（數(shù)據(jù)未列示）。同時(shí)，為進(jìn)一步驗(yàn)證大花序桉種子園的自交情況，也將5-018 作為父本進(jìn)行了分析，未發(fā)現(xiàn)母本的自交子代，表明大花序桉自交的可能性極低。

表2 鑒定的父本和子代數(shù)量及全同胞家系的多樣性參數(shù)和平均苗高?Table 2 Paternal parents,their sib numbers,and full-sib family derived heterozygosity and seedling mean height

基于試驗(yàn)林種植圖的父本與母本的距離，分析大花序桉花粉散布規(guī)律，可推測(cè)花粉傳播的距離。圖2顯示了父本的距離及其子代數(shù)量，可見大花序桉花粉散布的距離較遠(yuǎn)，可達(dá)160 m，但主要范圍在100 m，在此距離范圍內(nèi)，共產(chǎn)生了1 436 株子代，占已確定父本子代數(shù)量的84.6%，而在100～160 m 內(nèi)僅277 株子代，占15.4%，這進(jìn)一步表明100 m 之外大花序桉父本仍然可以為母本提供花粉，但隨著距離的增加、產(chǎn)生子代的數(shù)量明顯減少。特別地，父本16-059 距離母樹達(dá)135 m，但全同胞子代數(shù)量仍有155 株，圖1也顯示了標(biāo)記EUCeSSR345 對(duì)父本16-057 的3 株子代和5 株非親子代的分型結(jié)果。

圖2 父本與母本的距離及子代數(shù)量Fig.2 Parental distance and number of full-sibs

2.3 全同胞家系的標(biāo)記偏分離分析

對(duì)子代數(shù)量10株以上的7個(gè)全同胞家系（表3）的12 個(gè)標(biāo)記進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果表明，各標(biāo)記在不同家系中均存在不同程度的偏離期望的孟德爾分離比例，每個(gè)家系偏分離標(biāo)記的數(shù)量從2～9個(gè)不等（P≤0.05），平均為6.1 個(gè)。父本10-039的全同胞家系中，標(biāo)記EMBRA8 的χ2值高達(dá)308.62，嚴(yán)重偏分離。此外，標(biāo)記EUCeSSR444、EUCeSSR0256、EUCeSSR241 和EUCeSSR1116 標(biāo)記在多個(gè)全同胞家系中均存在無(wú)分離類型的現(xiàn)象。

表3 SSR 標(biāo)記在相應(yīng)父本的全同胞家系中分離比的卡方檢驗(yàn)?Table 3 χ2 test for marker segregation within each full-sib family with paternal parent identified

2.4 全同胞家系的多樣性及其與苗高生長(zhǎng)的相關(guān)

對(duì)于子代數(shù)量10 株以上的7 個(gè)全同胞家系（表2），多樣性參數(shù)均較低，如Ho為0.316～0.472、He為0.258～0.340，雜合度最高的家系是父本為5-017 的近交家系。t檢驗(yàn)也表明，異交家系與近交家系的Ho（t=0.227，P=0.822）和He（t=0.139，P=0.891）均無(wú)顯著差別。

這7 個(gè)全同胞家系4月生苗高的平均為18.21～33.96 cm，變異系數(shù)介于0.34～4.54%（表2）。Ho和He與平均苗高的相關(guān)系數(shù)分別為–0.173（P=0.710）和–0.194（P=0.677），與苗高變異系數(shù)的相關(guān)系數(shù)分別為–0.226（P=0.626）和–0.232（P=0.617），均無(wú)顯著相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)大花序桉1 株母本的2 184 株自由授粉子代進(jìn)行了父本鑒定，共有1 697 株（77.7%）子代確定了父本（花粉）來(lái)源。鑒定的比例高于木荷[17]（61.9%）和馬尾松[18]（72.5%），但低于美洲黑楊[16]（97.9%）、藍(lán)灰麻利[15]（92.4%）和日本落葉松[19]（93.7%）。父本鑒定的子代比例與多種因素有關(guān)，如引物數(shù)量與多態(tài)性、外來(lái)花粉污染和候選父本數(shù)量等。一般認(rèn)為，3～6 個(gè)共顯性標(biāo)記足以進(jìn)行異交群體的分型鑒定[35-36]，本研究所用的12個(gè)共顯性SSR標(biāo)記在數(shù)量上是足夠的，也具有較高的多態(tài)性[26]，子代鑒定的有效性應(yīng)較高。大花序桉為昆士蘭桉亞屬唯一種，不會(huì)與其他種雜交，將采集的試驗(yàn)林附近的桉樹人工林和行道樹（主要是無(wú)性系DH32-29 和廣9）20 株納入分析、也未發(fā)現(xiàn)有授粉（數(shù)據(jù)未列示），并且試驗(yàn)林周圍沒(méi)有其他大花序桉林分，因此不存在外來(lái)花粉污染的可能性。候選父本數(shù)量上，一般認(rèn)為超過(guò)100 時(shí)父本產(chǎn)生相同配子基因型的概率較高[37]而降低鑒定的有效性。本研究707 株候選父本且LOD 閾值較高，這在一定程度上影響了鑒定的子代比例；更為重要的是，大花序桉的蒴果可在母樹上留存3年，少數(shù)授粉父本可能在取樣時(shí)因多種原因死亡，因此無(wú)從追查父本來(lái)源，從而降低了鑒定比例。

SSR 位點(diǎn)變異也可能影響鑒定的有效性。在親子遺傳中，少數(shù)子代存在SSR 重復(fù)單元數(shù)的增減而產(chǎn)生非親等位片段的現(xiàn)象[38-39]，影響鑒定的準(zhǔn)確性。例如，Moriya 等[40]發(fā)現(xiàn)蘋果Malus×domesticaBorkh.子代SSR 突變是因?yàn)镾SR 重復(fù)單元數(shù)的增加，而兩端的序列（包括引物結(jié)合序列）沒(méi)有發(fā)生變化。

等位基因的偏分離作為生物進(jìn)化的動(dòng)力之一[41]，可以增加群體中雜合等位基因或者異型染色體的頻率，是生物界普遍存在的一種現(xiàn)象，特別是共顯性標(biāo)記。目前，造成偏分離的原因尚不清晰，一般認(rèn)為造成偏分離的原因與遺傳分離機(jī)制[42]、染色體缺失[43]、花粉選擇以及隱性致死等位基因遺傳負(fù)荷表達(dá)[44]等一系列因素有關(guān)，以上幾種造成基因偏分離現(xiàn)象的出現(xiàn)均是由于染色體的某些位置的重組率下降或者不發(fā)生重組造成的[45]。

大花序桉的授粉并非隨機(jī)的，而是遵從較近距離花粉優(yōu)先的原則[46]，散布范圍主要集中在100 m 以內(nèi)。隨著父本與母本距離的增大，授粉率逐漸降低，這與花粉流的強(qiáng)度隨父本距離增加而降低有關(guān)[47]。這也與Chaix 等[14]，Bezemer 等[15]和Eldridge 等[48]報(bào)道的桉樹研究結(jié)果相似。

本研究利用前期優(yōu)化的12 個(gè)可多重檢測(cè)的SSR 標(biāo)記，對(duì)大花序桉1 株母本的2 184 株自由授粉子代進(jìn)行了父本鑒定，獲得了6 個(gè)130 株以上的全同胞家系，本研究的結(jié)果可以為大花序桉進(jìn)一步分析研究奠定材料基礎(chǔ)，如遺傳資源測(cè)定、遺傳圖譜構(gòu)建和數(shù)量性狀位點(diǎn)定位等研究。