趙海梅，靳燕嬰，黃榮

(1.青海省海東市樂(lè)都區(qū)畜牧獸醫(yī)站2.青海省剛察縣動(dòng)物疫病控制中心3.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院)

生物體能夠在生理和行為上適應(yīng)晝夜節(jié)律[1]。哺乳動(dòng)物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)由分層多時(shí)鐘結(jié)構(gòu)組成，從分子、細(xì)胞到機(jī)體等不同層系上都表現(xiàn)出明顯的時(shí)間周期現(xiàn)象[2]。Clock(circadian locomotor output cycles kaput)基因是生物鐘家族重要的核心基因之一，廣泛表達(dá)于視交叉上核以及外周組織。牦牛是青藏高原的重要家畜，對(duì)于高原的低溫低氧極端環(huán)境有很好的適應(yīng)性。由于這種極端環(huán)境的影響，使得牦牛與其他的牛種生理代謝水平有一定的差異。Clock作為動(dòng)物生物鐘家族的核心成員，可能參與牦牛適應(yīng)復(fù)雜高原環(huán)境的代謝調(diào)控。因此，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對(duì)牦牛不同組織中CLOCK基因表達(dá)進(jìn)行比較研究，為生物鐘基因在調(diào)控牦牛生理代謝功能研究中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需的樣品采集于西寧市本地屠宰場(chǎng)。分別采4頭體型一致成年母牦牛下丘腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢和肌肉等樣品，將采集的新鮮樣品用生理鹽水沖洗去血漬、切成小塊并裝入凍存管后立刻放入液氮速凍，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室將樣品轉(zhuǎn)入超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 組織總RNA提取以及cDNA的合成

取0.5g組織樣品在研缽中加入液氮磨碎，使用TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)并根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取組織的總RNA，適量的無(wú)RNA酶水溶解。用核酸蛋白儀Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度，同時(shí)取6 μL提取的RNA用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA的完整性。分裝RNA并置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，根據(jù)說(shuō)明按步驟對(duì)提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，得到的cDNA可以進(jìn)行常規(guī)PCR和RT-PCR。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中牦牛CLOCK(登錄號(hào)：XM_014479222.1)基因和內(nèi)參基因GAPDH(登錄號(hào)：XM_014482068.1)mRNA序列，利用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物，并交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以下是CLOCK和GAPDH的引物序列：CLOCK(F:TAGTAACCGCTCCTGTAGCCTGTG,R:GCTGCTGCTGCGTGACTGAC，產(chǎn)物135bp)，GAPDH(F:ACCATCTTCCAGGAGCGAG,R:ATGATGACCCTCTTGGCGC，產(chǎn)物140bp)。

1.4 引物的特異性檢驗(yàn)

應(yīng)用常規(guī)PCR檢測(cè)引物的特異性，反應(yīng)體系：2×Taq Mix12.5μL，上游引物2μL，下游引物2μL，cDNA 2μL，ddH2O 6.5μL。反應(yīng)程序：95℃ 預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)(95℃ 30 s，60℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，時(shí)間30 min。

1.5 RT-PCR

分別檢測(cè)CLOCK基因在牦牛各組織的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq(2×)10μL(寶生物工程有限公司)，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，Dye 0.4μL，cDNA 2μL，ddH2O 6μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，(95℃變性5 s，60℃退火30s，72℃延伸30 s)共35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。每組實(shí)驗(yàn)4個(gè)技術(shù)重復(fù)，4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)用One-Way ANOVA分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性

用卵巢cDNA模板分別擴(kuò)增CLOCK和GAPDH目的片段，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中清晰觀察到目的產(chǎn)物在100bp附近，與所設(shè)計(jì)引物的目的產(chǎn)物CLOCK的135 bp和GAPDH的140 bp大小相一致，而且它們均為單一條帶(圖 1)，說(shuō)明引物特異性高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 卵巢CLOCK和GAPDH的擴(kuò)增結(jié)果M：DNA標(biāo)準(zhǔn)；1-4：CLOCK；5-8：GAPDH M：DNA Marker ；1-4：CLOCK；5-8：GAPDH

2.2 RT-PCR檢測(cè)目的基因和內(nèi)參基因的特異性

以制備的卵巢cDNA模板，對(duì)CLOCK和GAPDH基因進(jìn)行RT-PCR，分別得到CLOCK和GAPDH基因的溶解曲線。橫坐標(biāo)代表溶解溫度(單位：℃)；縱坐標(biāo)為溶解曲線反應(yīng)的相對(duì)熒光讀數(shù)(RFU值)即：溫度變化速率/溫度值。顯示溶解曲線峰值單一，PCR產(chǎn)物Tm值相對(duì)匯合，表明引物特異性良好，PCR過(guò)程中沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，排除了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能。綜上所述，設(shè)計(jì)的引物可以準(zhǔn)確的反應(yīng)目的基因擴(kuò)增時(shí)的相對(duì)表達(dá)量。

圖2 牦牛卵巢Clock和GAPDH的溶解曲線

2.3CLOCK基因在牦牛各組織的相對(duì)表達(dá)量

分別提取母牦牛下丘腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢和肌肉組織mRNA，利用RT-PCR檢測(cè)CLOCK基因表達(dá)量，GAPDH為內(nèi)參基因。結(jié)果顯示牦牛CLOCK基因在下丘腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢以及肌肉中均有表達(dá)，且在肺臟和腎臟中高表達(dá)，在心臟中的表達(dá)量最低(表1，圖3)。CLOCK基因在牦牛不同組織廣泛表達(dá)，而且不同組織中含量差異顯著。推測(cè)CLOCK基因在牦牛晝夜節(jié)律調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。

表1 牦牛不同組織CLOCK基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖3 牦牛不同組織Clock基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

CLOCK基因在牦牛不同組織中的表達(dá)檢測(cè)表明，CLOCK基因在下丘腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢和肌肉8種組織中都有表達(dá)，這與其它動(dòng)物的檢測(cè)結(jié)果相一致[9,10]。本研究結(jié)果表明，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，牦牛不同組織內(nèi)CLOCK基因的表達(dá)量存在有很大的區(qū)別，其中腎腺中CLOCK的表達(dá)量最高，心臟中的表達(dá)量最低。

下丘腦是調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的中央時(shí)鐘，同時(shí)也是調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的重要樞紐。CLOCK基因在禽類下丘腦—垂體—性腺軸中參與生殖系統(tǒng)發(fā)育和繁殖性能的主要調(diào)控[11]。通過(guò)原位雜交發(fā)現(xiàn)，大鼠CLOCK基因主要表達(dá)在卵巢顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞以及黃體細(xì)胞中(Circadian clocks in the ovary)。卵巢的排卵具有自主節(jié)律，但是這種節(jié)律容易受到黃體激素的影響。我們觀察到牦牛卵巢CLOCK基因表達(dá)量相較于除心臟以外的其他組織低，有可能與黃體激素的分泌相關(guān)。而有研究發(fā)現(xiàn)[12]，動(dòng)物下丘腦中Clock基因的表達(dá)會(huì)隨著年齡的增加而表達(dá)量和節(jié)律性出現(xiàn)降低的現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，在牦牛下丘腦中，CLOCK基因的表達(dá)量較低，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)樣品采自成年牦牛，其下丘腦的節(jié)律性調(diào)控作用減弱導(dǎo)致。在Clock基因與代謝功能的研究中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)敲除了Clock基因的小鼠會(huì)導(dǎo)致大量的膽固醇無(wú)法發(fā)生正常代謝而聚集在肝臟中，說(shuō)明Clock基因參與肝臟代謝功能的調(diào)節(jié)[13]；心臟的心肌細(xì)胞在甘油三酯水平的合成及脂肪分解起著重要作用[14]。在本研究中，牦牛Clock基因在肝臟中的表達(dá)量高于心臟，這可能是肝臟和心臟所行使的代謝機(jī)能不同所致。作為主要的免疫器官，Clock基因在脾臟存在表達(dá)，且表達(dá)量較高，這提示了在牦牛中，Clock基因可能參與機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)。在研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，Clock基因在牦牛的肺臟和腎臟都有著較高的表達(dá)量，而腎臟中的Clock基因表達(dá)量最高，由此可推測(cè)Clock基因可能在牦牛的泌尿功能上參與調(diào)節(jié)。在其它動(dòng)物上，Clock基因被證實(shí)存在于性腺組織中，并參與調(diào)控動(dòng)物的生殖代謝[11]。在本試驗(yàn)中，我們檢測(cè)出牦牛卵巢中存在Clock基因，這為今后研究該基因在牦牛卵巢中激素分泌及卵泡發(fā)育功能提供依據(jù)。此外，本研究顯示Clock基因在牦牛肌肉的組織中有著較高的表達(dá)，揭示Clock基因可能在牦牛調(diào)節(jié)肌肉節(jié)律性活動(dòng)中具有一定的調(diào)節(jié)作用。

Clock基因的這種不同組織的相對(duì)表達(dá)差異也在其它物種中表現(xiàn)：Liu[14]等在鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，Clock基因在鼠的肝臟的表達(dá)量高于脾臟的表達(dá)量；而在雞的組織中，胸肌的表達(dá)量最高，腎臟、心臟、下丘腦中度表達(dá)，肝臟、腸道、卵巢低度表達(dá)[9]。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示，不同牦牛組織中，Clock基因的表達(dá)量存在一定的差異，這可能取決于基因在不同組織中所參與的調(diào)控功能的差異有關(guān)，具體功能機(jī)制還需進(jìn)一步研究。