張玉彬,劉文科,楊其長,邵明杰,查凌雁,周成波,李寶石,王奇

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部設(shè)施農(nóng)業(yè)節(jié)能與廢棄物處理重點實驗室，北京 100081)

抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)，又稱維生素C，是一種抗氧化劑。AsA與其他抗氧化劑共同組成抗氧化系統(tǒng)，可保護植物免受有氧代謝、光合作用和多種污染物等造成的氧化損害[1]。AsA與人類健康關(guān)系密切，人類及動物自身無法合成AsA，必須通過飲食獲取[2]。AsA可通過參與AsA-GSH循環(huán)途徑清除人體內(nèi)過多的活性氧[3]。AsA通過反應(yīng)底物或酶輔助因子的形式參與人體內(nèi)膠原合成過程等多種生化反應(yīng)，膠原蛋白缺乏會導(dǎo)致壞血病的發(fā)生[4]。AsA還有降低血脂和抑制致癌物質(zhì)產(chǎn)生等作用[5]。此外，AsA也是蔬菜中的重要品質(zhì)物質(zhì)，由于人體無法合成AsA，蔬菜成為人體AsA的主要來源。

目前，已經(jīng)探明的AsA合成途徑主要是L-半乳糖途徑[6]。L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶(L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase，GalLDH)是植物AsA合成途徑中最后一步的酶，它的活性決定了AsA含量的高低。植物體內(nèi)的AsA主要是通過抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和抗壞血酸氧化酶(ascorbate oxidase，AO)被氧化分解為單脫氫抗壞血酸(monodehydroascorbic acid，MDHA)，MDHA可以生成脫氫抗壞血酸(dehydroascorbic acid，DHA)，或通過單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase，MDHAR)再次還原為AsA。而氧化形成的DHA可以在脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbic acid reductase，DHAR)的作用下被還原為AsA，或者被水解為2,3-二酮古洛糖酸。谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)作為氧化還原酶，可催化氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)還原為還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)，進而維持植物體內(nèi)GSH的含量，DHA還原再生為AsA的過程需要GSH提供電子供體[7]。植物AsA含量的高低是合成、降解、轉(zhuǎn)運各種代謝之間共同作用的結(jié)果[3]。AsA的合成代謝受多種環(huán)境因子的影響[8-9]，如光照、溫度等對AsA積累會產(chǎn)生顯著的影響，其中光環(huán)境對AsA代謝途徑的影響尤為重要。光環(huán)境的變化可以顯著影響植物的生長發(fā)育及其葉片的光合作用進程，同時，光合作用所生成的碳水化合物也為植物AsA的合成代謝提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，光環(huán)境對于植物體內(nèi)AsA含量有重要影響。

連續(xù)光照通常是指改變植物原有的明暗交替的光周期規(guī)律，給植物提供連續(xù)24 h或超過24 h的光照。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)光照可加速植物的生長、增加生物量、提高品質(zhì)等[10-12]。Ohyama等[13]研究表明，連續(xù)光照促使番茄植株鮮重、干重及葉面積等顯著提高；周晚來[14]研究發(fā)現(xiàn)，在生菜采收前，進行短期連續(xù)光照可以顯著降低水培生菜的硝酸鹽含量并提高可溶性糖、AsA等營養(yǎng)物質(zhì)的含量；Zha等[15]在生菜幼苗移栽10 d后進行12 d不同光強的連續(xù)光照，結(jié)果表明，抗壞血酸含量和參與AsA代謝的酶活性與連續(xù)光照光強呈正相關(guān)關(guān)系，且APX和DHAR酶活性對連續(xù)光照光強的響應(yīng)分別最大和最小。光譜組成也是影響連續(xù)光照對植物作用效果的重要光環(huán)境因子之一，適當?shù)募t藍光質(zhì)比例可以有效提高植物的的產(chǎn)量和品質(zhì)。但目前關(guān)于采前連續(xù)光照光質(zhì)對于AsA的影響機理尚不清楚。

生菜是一種被廣泛食用的葉菜類蔬菜，也是人工光植物工廠廣泛種植的代表性蔬菜。在植物工廠內(nèi),生菜生產(chǎn)通常以提高氮素投入的方法來提高其產(chǎn)量，但以AsA為代表的營養(yǎng)物質(zhì)含量卻顯著降低。解決在提高水培生菜產(chǎn)量的同時，又提升生菜體內(nèi)AsA等營養(yǎng)物質(zhì)含量的問題具有重要的現(xiàn)實意義。本研究在水培生菜生長過程中，采用LED紅藍光進行采前72 h連續(xù)光照處理提高生菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時探究采前連續(xù)光照光質(zhì)對水培生菜體內(nèi)AsA相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)影響，更深層次地闡明采前連續(xù)光照光質(zhì)對生菜體內(nèi)AsA的影響機理，以期為植物工廠中高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蔬菜的生產(chǎn)中采前連續(xù)光照光質(zhì)的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所植物工廠內(nèi)進行，栽培環(huán)境溫度為(25±1)℃，相對濕度為65%±5%。生菜前期育苗和試驗期間均采用營養(yǎng)液水培，營養(yǎng)液配方為：4 mmol·L-1Ca(NO3)2·4 H2O、0.75 mmol·L-1K2SO4、0.5 mmol·L-1KH2PO4、0.1 mmol·L-1KCl、0.65 mmol·L-1Mg SO4·7 H2O、1.0×10-3mmol·L-1H3BO3、1.0×10-3mmol·L-1MnSO4·H2O、1.0×10-4mmol·L-1CuSO4·5H2O、1.0×10-3mmol·L-1ZnSO4·7 H2O、5×10-6mmol·L-1(NH4)6Mo7O24·4 H2O、0.1 mmol·L-1EDTA-Fe。

1.2 試驗設(shè)計

試驗以“意大利耐抽薹”生菜(LactucasativaL.)為試驗材料，先將種子播種于海綿塊中育苗，培養(yǎng)15 d后將大小一致的生菜苗隨機移栽于長方形塑料栽培槽(長180 cm、寬60 cm、高6 cm)內(nèi)，并于次日開始光照試驗。

試驗前期正常光照采用LED紅藍光面板燈進行光照處理，LED燈的光照強度為150 μmol·m-2·s-1，紅光與藍光的組成比例為4∶1，光暗周期設(shè)置為16 h/8 h，光期時間段為6:00—22:00。植物工廠生菜因品種不同，生長發(fā)育速度也不同，本試驗統(tǒng)一連續(xù)培養(yǎng)17 d，生菜長到15片葉左右，達到采收標準時，開始進行不同比例紅(R)藍(B)光質(zhì)的光照集中連續(xù)處理72 h，從定植后第18 d的6：00開始，在第21 d的6：00光照結(jié)束。連續(xù)光照紅藍光質(zhì)比例設(shè)置5個處理，分別為1∶4(1R:4B)、1∶2(1R:2B)、1∶1(1R:1B)、2∶1(2R:1B)和4∶1(4R:1B)。同時以采前72 h連續(xù)光照處理前的取樣(BCL)作為對照處理。每個處理栽培生菜26株，選用紅光波峰為655 nm，藍光波峰為430 nm的LED紅藍光組合燈板(49 cm×49 cm)進行光照處理。燈板放置在栽培槽上方40 cm處。

1.3 測定指標及方法

在集中連續(xù)照射開始和結(jié)束時取樣，采用葉綠素含量測定儀(SPAD-502，Konica Minolta，日本)測定葉綠素含量 (SPAD)。分別于每個處理中隨機選8株生菜作為重復(fù)樣本，從莖基部切開。其中4株的地上部分將葉片與葉柄分離后，迅速用液氮冷凍，并用高通量組織研磨器在低溫下把用液氮冷凍好的植物樣品研磨成粉末，放至-80 ℃冰箱中留樣備用；另外4株用電子計數(shù)天平稱取地上部鮮重和根鮮重，用葉面積儀(Li-3100C，Li-Cor，Biosciences，美國)測量整株生菜葉片的葉面積，然后將生菜100 ℃殺青20 min，80 ℃ 烘干至恒重，用分析天平分別稱取地上部干重和根干重。采用便攜式光合儀(LI-6400XT，NE，美國)分別在采前連續(xù)光照前后分2次測定生菜不同處理下葉片的凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、蒸騰速率(transpiration rate，Tr)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)和氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，Gs)。

硝酸鹽含量采用硫酸-水楊酸法[16]測定，可溶性糖含量采用硫酸-苯酚法[17]測定。APX酶活性參考文獻[18]的測定方法測定。DHAR、MDHAR和GR的酶活性參照Ma等[19]方法測定。GalLDH酶活性均采用試劑盒測定?？箟难岷繀⒖糞pínola等[20]方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2015進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗分析(LSD法，α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前不同比例LED連續(xù)光照對生菜生長的影響

2.1.1對生菜生物量的影響 由表1可知，與連續(xù)光照前(BCL)相比，采前72 h進行LED連續(xù)光照后，地上部鮮重和干重以及根的鮮重和干重均顯著增加。其中，地上部鮮重的增幅為38.82%～77.65%，1R:4B處理下的地上部鮮重最小為23.60 g，2R:1B處理下的地上部鮮重最大達到30.23 g；地上部干重的增幅為89.74%～94.87%，各處理間地上部干重無顯著差異；根鮮重的增幅為27.43%～73.14%，1R:2B處理下的根鮮重最小為2.23 g，4R:1B處理下的根鮮重最大為3.03 g；根干重的增幅為39.84%～65.38%，各處理間的根干重無顯著差異?？梢?，采前LED連續(xù)光照光質(zhì)的紅光比例越低，地上部和根的鮮重越低。采前LED連續(xù)光照光質(zhì)的紅藍光比例對地上部和根的干重無顯著影響。

表1 不同處理下的生菜生物量Table 1 Lettuce biomass under different treatments

2.1.2對生菜生長指標的影響 采前LED連續(xù)光照光質(zhì)對生菜的形態(tài)指標具有顯著影響。由表2可知，與連續(xù)光照前(BCL)相比，采前72 h進行LED連續(xù)光照處理后，生菜的葉面積、SPAD(葉綠素含量)、干物質(zhì)含量和比葉重均顯著增加。其中，葉面積的增幅為32.43%～68.09%，1R:4B處理下生菜葉面積最小為477.58 cm2，2R:1B處理下生菜葉面積最大達到606.15 cm2。SPAD的增幅為27.42%～70.85%，1R:1B處理下的SPAD最小為23.47，4R:1B處理下的SPAD最大為31.47。干物質(zhì)含量的增幅為5.62%～37.27%，2R:1B處理下的干物質(zhì)含量最小為4.86%，1R:4B處理下的干物質(zhì)含量最大為6.31%。比葉重的增幅為12.80%～44.09%，2R:1B處理下的比葉重最小為2.44 mg·cm-2，1R:4B處理下的比葉重最大為3.11 mg·cm-2?？梢?，采前LED連續(xù)光照光質(zhì)的紅光比例越高，生菜的葉面積和SPAD越高；采前LED連續(xù)光照光質(zhì)的紅光比例越低，生菜的干物質(zhì)含量和比葉重越高。

表2 不同處理下的生菜生長指標Table 2 Growth index of lettuce under different treatments

2.2 采前不同比例LED連續(xù)光照對生菜光合特性的影響

采前LED連續(xù)光照光質(zhì)對生菜葉片的光合特性具有顯著影響。由表3可知，與連續(xù)光照前(BCL)相比，生菜葉片的凈光合速率(Pn)的變化幅度為-35.11%～62.00%，采前LED連續(xù)光照處理后，4R:1B處理下，生菜葉片的Pn有所降低，為7.65 μmol·m-2·s-1，1R:4B處理下生菜葉片的Pn最高達到19.10 μmol·m-2·s-1。生菜葉片的氣孔導(dǎo)度(Gs)的降低幅度為26.97%～62.34%，采前LED連續(xù)光照處理后，1R:1B處理下生菜葉片的Gs最低為0.148 mol·m-2·s-1，1R:4B處理下生菜葉片的Gs最高達到0.287 mol·m-2·s-1。生菜葉片的胞間CO2濃度(Ci)的降低幅度為9.68%～24.97%，采前LED連續(xù)光照處理后，1R:1B處理下生菜葉片的Ci最低為252.69 μmol·mol-1，1R:4B處理下生菜葉片的Ci最高達到304.18 μmol·mol-1。生菜葉片的蒸騰速率(Tr)的降低幅度為34.15%～58.74%，采前LED連續(xù)光照處理后，1R:1B處理下生菜葉片的Tr最低為2.03 mmol·m-2·s-1，1R:4B處理下生菜葉片的Tr最高達到3.24 mmol·m-2·s-1。

表3 不同處理下的生菜光合特性Table 3 Photosynthetic characteristics of lettuce under different treatments

2.3 采前不同比例LED連續(xù)光照對生菜可溶性糖和硝酸鹽含量的影響

由表4可得，與BCL相比，采前72 h進行LED連續(xù)光照處理后，生菜的可溶性糖含量不同程度的升高，硝酸鹽含量不同程度的降低。葉片的可溶性糖含量增加幅度為1.46%～47.17%，1R:2B處理下葉片的可溶性糖含量最低為17.38 mg·g-1，4R:1B處理下葉片的可溶性糖含量最高達到25.21 mg·g-1。葉柄的可溶性糖含量增加幅度為26.08%～67.36%，1R:2B處理下葉柄的可溶性糖含量最低為32.68 mg·g-1，4R:1B處理下葉柄的可溶性糖含量最高達到43.38 mg·g-1。葉片的硝酸鹽含量降低幅度為4.94%～28.24%，4R:1B處理下葉片的硝酸鹽含量最低為256.91 mg·kg-1，1R:2B處理下葉片的可溶性糖含量最高為340.34 mg·kg-1。采前LED連續(xù)光照處理后，葉柄的硝酸鹽含量降低幅度為6.96%～24.71%，2R:1B處理下葉柄的硝酸鹽含量最低為371.51 mg·kg-1，1R:1B處理下葉柄的可溶性糖含量最高為459.08 mg·kg-1?？梢?，采前LED連續(xù)光照光質(zhì)紅光比例越高，生菜葉片和葉柄的可溶性糖含量越高，生菜葉片的硝酸鹽含量越低。

表4 不同處理下的生菜可溶性糖和硝酸鹽含量Table 4 Contents of soluble sugar and nitrate in lettuce under different treatments

2.4 采前不同比例LED連續(xù)光照對生菜AsA代謝的影響

2.4.1對生菜AsA和DHA含量的影響 由表5可知，與BCL相比，采前72 h進行LED連續(xù)光照處理后，生菜的AsA含量有所升高。其中，葉片的AsA含量的增加幅度為25.15%～92.81%，4R:1B處理下葉片的AsA含量最低為2.09 mg·g-1，1R:4B處理下葉片的AsA含量最高達到3.22 mg·g-1。葉柄的AsA含量變化無顯著差異。葉片的DHA含量增加幅度為61.90%～204.76%，葉柄的DHA含量降低幅度為47.83%～52.17%，但采前LED連續(xù)光照后，各光質(zhì)處理間葉片和葉柄的DHA含量均無顯著差異。可見，采前LED連續(xù)光照光質(zhì)藍光比例越高，生菜的AsA含量越高，采前LED連續(xù)光照光質(zhì)對葉柄的AsA和DHA含量無顯著影響。

表5 不同處理下的生菜AsA和DHA含量Table 5 Contents of AsA and DHA in lettuce under different treatments

2.4.2對生菜GalLDH酶活性的影響 由表6可得，采前LED連續(xù)光照光質(zhì)對葉片的GalLDH酶活性具有顯著影響。與連續(xù)光照前(BCL)相比，采前LED連續(xù)光照后，葉片的GalLDH酶活性的變化幅度為-65.58%～5.56%，相比于連續(xù)光照前，僅有4R:1B處理下的葉片GalLDH酶活性略高于連續(xù)光照前的，達到0.281 U·mg-1FW。其他處理下葉片GalLDH酶活性均低于連續(xù)光照前的，1R:4B處理下葉片的GalLDH酶活性最低為0.092 U·mg-1FW。采前LED連續(xù)光照光質(zhì)處理對葉柄的GalLDH酶活性無顯著影響。采前LED連續(xù)光照光質(zhì)紅光比例越高，葉片的GalLDH酶活性越高。

表6 不同處理下的生菜GalLDH酶活性Table 6 Activity of GalLDH in lettuce under different treatments

2.4.3對生菜AsA代謝相關(guān)酶活性的影響 由表7可知，采前LED連續(xù)光照前(BCL)，生菜葉片的APX酶活性為0.28 U·mg-1FW，72 h 連續(xù)光照后，1R:4B和1R:2B處理下的生菜葉片APX酶活性顯著增加，均增加了0.16 U·mg-1FW。生菜葉片的MDHAR酶活性在采前LED連續(xù)光照前為0.11 U·mg-1FW，72 h 連續(xù)光照后，1R:4B處理下的生菜葉片MDHAR酶活性顯著增加，增加了0.81 U·mg-1FW。相比于采前LED連續(xù)光照前，生菜葉片的DHAR和GR酶活性在72 h連續(xù)光照后均有所增加，但無顯著差異。生菜葉柄中APX、MDHAR、DHAR和GR的酶活性在72 h 連續(xù)光照后均無顯著差異?？梢姡汕癓ED連續(xù)光照光質(zhì)只對生菜葉片的APX和MDHAR具有顯著影響。采前LED連續(xù)光照光質(zhì)紅光比例越大，對APX和MDHAR的影響越小。各處理間葉柄的AsA代謝相關(guān)酶活性均無顯著影響。

表7 不同處理下的生菜AsA代謝相關(guān)酶活性Table 7 Activities of AsA metabolism related enzymes in lettuce under different treatments

3 討論

本研究結(jié)果表明，采前LED連續(xù)光照后生菜地上部鮮重和干重均顯著增加，連續(xù)光照的紅光比例越低，產(chǎn)量越低。這是因為紅光是被綠色植物吸收最多的光，紅光通過光敏色素在調(diào)控光形態(tài)建成上發(fā)揮作用，可以促進莖伸長，促進碳水化合物合成，使得植物生長更快，促進植物產(chǎn)量的增加，采前連續(xù)光照紅光比例降低導(dǎo)致生菜的產(chǎn)量降低。同時紅光有利于糖的合成，抑制氮的同化作用[21]。這也解釋了本研究中的結(jié)果，隨著連續(xù)光照紅光比例的增大，生菜的可溶性糖含量增加，硝酸鹽的含量略微減少。

周晚來[14]研究了光強150 μmol·m-2·s-1下，紅藍光質(zhì)比例分別為8、4、2和純紅光下的采前連續(xù)光照對AsA含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采前連續(xù)光照的藍光比例越高，越有利于AsA含量的增加。本研究繼續(xù)增加藍光在采前連續(xù)光照時的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨采前連續(xù)光照藍光比例的升高，葉片AsA含量逐漸增加，葉片DHA含量逐漸降低。GalLDH是催化AsA合成的關(guān)鍵酶，在AsA的合成上起著很大的作用[8]。本研究結(jié)果表明，隨著連續(xù)光照藍光比例的升高，葉片中GalLDH活性逐漸降低。因此，采前LED連續(xù)光照光質(zhì)對生菜葉片GalLDH活性的影響與抗壞血酸含量變化相反。本研究結(jié)果表明，葉片APX酶活性隨連續(xù)光照藍光比例的升高而增大，與AsA含量的變化趨勢一致，說明連續(xù)光照藍光比例越高，APX酶活性越高，催化分解AsA的量越多。Eltayeb等[22]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因番茄中MDHAR的高效表達提高了轉(zhuǎn)化為AsA的效率，降低MDHAR轉(zhuǎn)化為DHA的比率。葉片MDHAR酶活性隨連續(xù)光照藍光比例的升高而增大，與AsA含量的變化趨勢一致，說明連續(xù)光照藍光比例越高，MDHAR酶活性越高，催化分解為DHA那部分的MDHA轉(zhuǎn)化合成AsA的量越多。Chen等[5]研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)DHAR基因高效表達會通過加快AsA再生循環(huán)來增加AsA的含量，這促進了轉(zhuǎn)化為2,3-二酮古洛糖酸的DHA轉(zhuǎn)化為AsA的比例。這與Matsuda等[23]的研究結(jié)果一致。本研究中連續(xù)光照光質(zhì)對葉片DHAR酶活性影響不顯著，但葉片DHAR酶活性隨連續(xù)光照藍光比例的升高而略微增大，與AsA含量的變化趨勢一致，說明連續(xù)光照藍光比例越高，DHAR酶活性越高，催化分解為2,3-二酮古洛糖酸那部分DHA轉(zhuǎn)化合成AsA的量越多，但DHAR在連續(xù)光照下對AsA升高的貢獻有限[24]?？梢姡B續(xù)光照光質(zhì)對AsA含量的影響主要是與參與AsA再生循環(huán)系統(tǒng)的MDHAR酶活性相關(guān)，可能與DHAR酶活性相關(guān)。

綜上所述，采前連續(xù)光照光質(zhì)對水培生菜產(chǎn)量及品質(zhì)的調(diào)控效果有顯著影響。隨著采前連續(xù)光照紅光比例的升高，水培生菜的產(chǎn)量會逐漸升高，且可溶性糖含量逐漸升高。AsA含量隨采前連續(xù)光照藍光比例的增大而增加，這是AsA合成和再生循環(huán)系統(tǒng)綜合調(diào)控的結(jié)果，主要是因為藍光比例的增大提高了參與AsA再生循環(huán)系統(tǒng)的MDHAR酶活性，促進了MDHA轉(zhuǎn)化為AsA的效率。