秦子飛,王培樂,邢晗,韓立,卞華,楊晶,張曉堅

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450052;2.河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室,河南 南陽 473004;3.河南省精準(zhǔn)臨床藥學(xué)重點實驗室,河南 鄭州 450052)

CYP1A1是一種重要的細胞色素P450酶,主要分布于肝臟、腸道等器官[1]。它可以通過結(jié)構(gòu)中血紅素的鐵離子傳遞電子,氧化多環(huán)芳烴類物質(zhì)、黃曲霉毒素等致癌物,在致癌物的活化和解毒過程中起著重要的作用[2]。此外,雌激素經(jīng)CYP1A1氧化形成非致癌性的2-羥基雌激素,經(jīng)CYP1B1催化生成致癌性的4-羥基雌激素。雌激素的氧化代謝產(chǎn)物具有DNA損傷效應(yīng),與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān),高4-羥基雌激素/2-羥基雌激素比值已經(jīng)成為判斷腫瘤形成的重要標(biāo)志[3]。因此,CYP1A1在外源物清除及內(nèi)源物水平穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。

補骨脂是我國常用傳統(tǒng)中藥,具有補腎壯陽、補脾健胃之功效,臨床上常用于治療骨質(zhì)疏松、骨折等疾病[4-7]。香豆素、異戊烯基成分等是補骨脂的主要成分,也可能是其發(fā)揮藥效的活性成分[8]。已有研究表明補骨脂所含的香豆素Bakuchicin(補骨脂素和異補骨脂素的結(jié)構(gòu)類似物)能顯著抑制CYP1A的活性,對CYP1A1和CYP1A2均表現(xiàn)出競爭性抑制作用,抑制常數(shù)Ki值分別為0.11、0.32 μmol·L-1[9]。此外,補骨脂富含的異戊烯基黃酮類成分的結(jié)構(gòu)類似物6-Prenylnaringenin,可以通過作用于CYP1A1和CYP1B1,調(diào)節(jié)雌激素的羥基化代謝,進而起到植物雌激素樣作用[10]。補骨脂富含的成分可能通過藥物-藥物相互作用或改變內(nèi)源物代謝影響機體的生理狀態(tài)。

目前,關(guān)于補骨脂富含的異戊烯基成分對CYP1A1的抑制活性評價未見報道,這也增加了其可能出現(xiàn)不良反應(yīng)的風(fēng)險?；诖四康?本實驗將重點探討補骨脂富含的異戊烯基成分對CYP1A1的抑制活性評價,并結(jié)合分子對接實驗進行驗證,以期發(fā)現(xiàn)補骨脂中具有抑制CYP1A1活性的小分子化合物,為臨床解釋補骨脂不良反應(yīng)和合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-TQD-MS)儀:色譜系統(tǒng)為Waters ACQUITY I-Class超高效液相色譜儀(包括二元梯度泵,自動進樣器和柱溫箱),質(zhì)譜系統(tǒng)為Waters TQD三重四級桿質(zhì)譜,配套Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);BP211D精密電子天平購于北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;MTC-100恒溫振蕩器購于杭州米歐儀器有限公司;QL-861渦旋儀購于海門市其林貝爾儀器制造有限公司;3K-15高速冷凍離心機購于德國Sigma公司。

1.2 試劑與藥品

補骨脂藥材購于河南張仲景大藥房,產(chǎn)自河南南陽，經(jīng)王培樂博士和卞華教授鑒定為正品。補骨脂二氫黃酮、補骨脂定、異補骨脂查爾酮、異補骨脂二氫黃酮和補骨脂二氫黃酮甲醚(純度>98%)均購于大連美侖生物技術(shù)有限公司(圖1);氯化鎂、NADPH、7-乙氧基試鹵靈和試鹵靈均購于美國Sigma-Aldrich公司;重組CYP1A1酶購于美國Corning公司;甲醇、乙腈和水均為色譜純,購于北京迪科馬科技有限公司;其他有機溶劑均為分析純或以上。

圖1 補骨脂富含的異戊烯基成分的結(jié)構(gòu)

1.3 樣品制備

取補骨脂粉末(過3號篩)約0.1 g,精密稱定,置25 mL容量瓶中,加70%乙醇水溶液20 mL,超聲30 min(30 ℃，100 kHz),待溶液冷卻至常溫,加70%乙醇水溶液,定容至刻度,搖勻,過0.22 μm微孔濾膜,取濾液即得。HPLC-UV法分析結(jié)果顯示[11],異補骨脂二氫黃酮、補骨脂二氫黃酮、補骨脂定、異補骨脂查爾酮和補骨脂二氫黃酮甲醚含量分別為0.36、3.37、2.33、5.59、8.24 mg·g-1。分別精密稱取適量補骨脂二氫黃酮、補骨脂定、異補骨脂查爾酮、異補骨脂二氫黃酮、補骨脂二氫黃酮甲醚標(biāo)準(zhǔn)品,加入容量瓶,加入適量甲醇溶液,配制成濃度為10 mmol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 方法

2.1 體外孵育體系

體外孵育體系包括Tris-HCl溶液(50 mmol·L-1,pH=7.4),氯化鎂(5 mmol·L-1),底物(7-乙氧基試鹵靈溶液)，不同濃度抑制劑(補骨脂提取物或不同補骨脂異戊烯基成分)和CYP1A1溶液,將上述溶液混合后,在恒溫(37 ℃)振蕩器內(nèi),預(yù)孵育5 min,然后加入NADPH溶液(1 mmol·L-1),正式啟動代謝反應(yīng)[12]。孵育一定時間后,加入等體積的冰乙腈終止反應(yīng),將溶液渦旋30 s,13 800 r·min-1離心10 min,取2 μL上清液,進樣UHPLC-TQD-MS分析。

2.2 抑制活性評價

7-乙氧基試鹵靈(1 μmol·L-1)作為CYP1A1的探針底物,被用作評價補骨脂異戊烯基成分對CYP1A1活性的影響[12]。將7-乙氧基試鹵靈分別與不同濃度補骨脂提取物(0、1、10、100 mg·mL-1)或不同補骨脂異戊烯基成分(0、1、10、100 μmol·L-1)混合孵育,以不加上述補骨脂相關(guān)成分為對照組,評價補骨脂及補骨脂異戊烯基成分對CYP1A1的抑制活性。

以不同濃度補骨脂提取物(0、1、2.5、5、10、20、25、50、100 mg·mL-1)及其異戊烯基成分(補骨脂二氫黃酮、補骨脂定和異補骨脂查爾酮濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、10、20 μmol·L-1;異補骨脂二氫黃酮和補骨脂二氫黃酮甲醚濃度為0、1、2、4、8、10、20、40 μmol·L-1)對7-乙氧基試鹵靈代謝的抑制活性為縱坐標(biāo),抑制劑的濃度為橫坐標(biāo)進行非線性擬合,得到各抑制劑對CYP1A1的IC50值。通常,IC50<1 μmol·L-1為強抑制活性;IC50在1～10 μmol·L-1之間為中等強度抑制活性;IC50>10 μmol·L-1,為弱抑制活性[12]。

2.3 抑制反應(yīng)動力學(xué)評價

3種動力學(xué)模型包括競爭性抑制(方程1)、非競爭性抑制(方程2)和混合型抑制(方程3)。應(yīng)用這3種模型對數(shù)據(jù)進行擬合,計算出各自的赤池信息量準(zhǔn)則(Akaike information criterion,AIC)和施瓦茨信息準(zhǔn)則(Schwarz criterion,SC)值,AIC和SC值越小,模型擬合越合適,同時獲得相應(yīng)合適的Ki值[12]。V代表反應(yīng)速度;[S]和[I]分別是7-乙氧基試鹵靈和不同補骨脂異戊烯基成分的濃度;Ki代表酶與不同抑制劑之間的親和力;Km為米氏常數(shù),是酶促反應(yīng)達最大速度(Vmax)一半時的底物[S]的濃度;αKi是反映不同抑制劑與酶和相應(yīng)底物復(fù)合物親和力的參數(shù);當(dāng)α值遠大于1時,不同抑制劑的結(jié)合阻礙了酶與底物的結(jié)合,混合抑制模型變?yōu)楦偁幰种颇Ｐ汀?/p>

(1)

(2)

(3)

2.4 分析條件

色譜條件:BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),流動相為水(A)和乙腈(B)(二者均包含0.1%的甲酸),洗脫程序為0～0.4 min,10%B;0.4～1.4 min,10%～95%B;1.4～1.6 min,95%B;1.6～1.8 min,95%～10%B;1.8～2.0 min,10%B;流速為0.3 mL·min-1;柱溫35 ℃;進樣體積2 μL。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI);離子源毛細管電壓3.5 kV;離子源溫度350 ℃;脫溶劑氣流速650 L·h-1;正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),代謝產(chǎn)物試鹵靈的母離子→子離子對為214.050→186.020,錐孔電壓為60 V,二級碎裂能為25 V。

2.5 分子對接

為進一步了解競爭性抑制成分(補骨脂二氫黃酮與異補骨脂查爾酮)與CYP1A1的相互作用機理,我們采用Autodock 4.2軟件進行分子對接。從PDB蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中下載CYP1A1蛋白與選擇性抑制劑α-萘黃酮的蛋白-配體結(jié)晶復(fù)合物(PDB:4I8V)[13-14],以此為模板,選擇高精度對接模式,先將蛋白復(fù)合物中水分子和SO4等其他小分子配體去除,然后進行加氫處理,以配體α-萘黃酮所結(jié)合的口袋為參照自動生成結(jié)合活性口袋,其他參數(shù)如未加以說明,均按默認參數(shù)設(shè)置。然后將補骨脂二氫黃酮與異補骨脂查爾酮分別對接到上述活性口袋,利用可視化軟件將對接后的配體-蛋白復(fù)合物進行作圖,并標(biāo)示在配體5 ?距離范圍內(nèi)的氨基酸殘基。此外,應(yīng)用拉馬克遺傳算法分別計算補骨脂二氫黃酮、異補骨脂查爾酮與CYP1A1結(jié)構(gòu)對接的結(jié)合自由能,不同形式的對接結(jié)構(gòu)對應(yīng)不同的結(jié)合自由能,結(jié)合自由能越低表示該種對接結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定,即最優(yōu)結(jié)構(gòu)[15];同時,我們還通過分析氫鍵與疏水作用揭示CYP1A1分別與補骨脂二氫黃酮和異補骨脂查爾酮的相互作用[15]。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 補骨脂及其異戊烯基成分對CYP1A1活性的影響

如圖2所示,當(dāng)補骨脂提取物為10 mg·mL-1時,CYP1A1剩余的催化活性為對照組的62%,而當(dāng)提取物濃度為100 mg·mL-1時,剩余活性僅為對照組的3%;通過數(shù)據(jù)擬合(圖3),得到補骨脂提取物對CYP1A1的抑制IC50值為14.97 mg·mL-1,見表1。

圖2 補骨脂提取物及5個異戊烯基成分 對CYP1A1的抑制活性

補骨脂二氫黃酮、補骨脂定和異補骨脂查爾酮對CYP1A1均表現(xiàn)出較強的抑制活性,當(dāng)3者濃度均為1 μmol·L-1時,CYP1A1剩余的催化活性分別為對照組的21.2%、31.3%和26.1%(圖2),隨后計算得到IC50值分別為0.28、0.49、0.36 μmol·L-1(圖3)。異補骨脂二氫黃酮和補骨脂二氫黃酮甲醚對CYP1A1表現(xiàn)出中等強度的抑制,即當(dāng)2者濃度為1 μmol·L-1時,CYP1A1的剩余活性分別為61.3%和93.1%(圖2),IC50值分別為2.24 μmol·L-1和4.07 μmol·L-1(圖3)。

3.2 補骨脂異戊烯基成分對CYP1A1抑制機制

本研究僅對具有強抑制活性的補骨脂異戊烯基成分(補骨脂二氫黃酮、補骨脂定和異補骨脂查爾酮)對CYP1A1的機制進行深入探討。根據(jù)最小AIC和SC值即為最佳抑制模型的原則(表1),補骨脂二氫黃酮和異補骨脂查爾酮對CYP1A1表現(xiàn)出競爭性抑制模式,而補骨脂定對CYP1A1表現(xiàn)出非競爭性抑制模式。此外,補骨脂二氫黃酮、補骨脂定和異補骨脂查爾酮對CYP1A1的Dixon圖(圖4)也為上述判斷提供了強有力的證據(jù)。數(shù)據(jù)擬合得到的Ki值分別為0.12、0.59、0.23 μmol·L-1(表1)。

圖3 補骨脂提取物及5個異戊烯基成分對CYP1A1的抑制曲線和IC50值

圖4 補骨脂二氫黃酮、補骨脂定和異補骨脂查爾酮對CYP1A1介導(dǎo)的7-乙氧基試鹵靈去乙氧基活性的抑制作用

表1 補骨脂異戊烯基成分對CYP1A1抑制作用的動力學(xué)參數(shù)

3.3 分子對接

圖5 α-萘黃酮與CYP1A1的氨基酸殘基相結(jié)合的活性位點(A)、氫鍵作用(B)與疏水作用(C)

3.3.1α-萘黃酮與CYP1A1的分子對接 通過分析活性位點發(fā)現(xiàn),α-萘黃酮與CYP1A1氨基酸殘基特異性結(jié)合的活性位點為Asp320、Phe224、Ser116、Ile386、Leu496、Thr497、Thr321、Ser122、Phe123、Ala317、Phe319、Gly316、Asp313、Ser120、Ile115、Leu312、Asn222、Asn255、Leu254和Phe258(圖5A);此外,α-萘黃酮與CYP1A1氨基酸殘基Ser116連接形成1個氫鍵,并與Phe224相連接形成1個π-π鍵(圖5B);α-萘黃酮與CYP1A1的氨基酸殘基Leu496、Thr321、Asp320、Ala317、Phe319、Phe224、Asp313、Phe258、Gly316、Ile115、Ser116、Asn255和Leu312相連接形成疏水作用(圖5C)。α-萘黃酮與CYP1A1的結(jié)合自由能為-10.861 kcal·mol-1(1 kcal=4.2 kJ)。

3.3.2 補骨脂二氫黃酮、異補骨脂查爾酮與CYP1A1的分子對接 對接結(jié)果顯示,補骨脂二氫黃酮與CYP1A1氨基酸殘基特異性結(jié)合的活性位點為Phe123、Ser122、Phe319、Asp320、Thr321、Thr497、Val382、Leu496、Thr385、Ile386、Ala317、Phe224、Gly316、Asp313、Leu254、Leu312、Phe258、Asn255、Ile115、Ser116和Tyr259(圖6A);補骨脂二氫黃酮與CYP1A1氨基酸殘基Ser122相連接形成1個氫鍵,并與Phe123相連接形成1個π-π鍵(圖6B);與CYP1A1氨基酸殘基Asn255、Phe258、Ser116、Gly316、Phe224、Ala317、Thr497、Thr321、Val382、Leu496、Ser122、Ile386、Asp313、Phe123、Leu312和Ile115相連接形成疏水作用(圖6C);補骨脂二氫黃酮與CYP1A1的結(jié)合自由能為-10.145 kcal·mol-1。

圖6 補骨脂二氫黃酮與CYP1A1的氨基酸殘基相結(jié)合的活性位點(A)、氫鍵作用(B)與疏水作用(C)

異補骨脂查爾酮與CYP1A1的氨基酸殘基特異性結(jié)合的活性位點為Phe123、Tyr259、Phe258、Glu256、Ser116、Asn255、Leu254、Ile115、Ser122、Gly316、Asp313、Leu312、Asp320、Ala317、Phe319和Thr321(圖7A);異補骨脂查爾酮與CYP1A1的氨基酸殘基Asn255相連接形成1個氫鍵,并與Phe123相連接形成1個π-π鍵(圖7B);而異補骨脂查爾酮與CYP1A1的氨基酸殘基Asn255、Val382、Thr321、Ser122、Phe123、Ile115、Ser116、Phe258、Leu312、Gly316、Phe224、Ala317、Asp313、Ile386和Leu496相連接形成疏水作用(圖7C)。異補骨脂查爾酮與CYP1A1的結(jié)合自由能為-8.286 kcal·mol-1。

3.4 補骨脂異戊烯基成分對CYP1A1活性的構(gòu)效關(guān)系分析

根據(jù)異戊烯基成分的結(jié)構(gòu)特征,我們發(fā)現(xiàn),二氫黃酮類成分C環(huán)1位和2位開環(huán)形成查爾酮,會使CYP1A1的抑制活性稍微減弱;A環(huán)上C-6位或C-8位用異戊烯基基團取代,化合物對CYP1A1的抑制活性差異顯著,以C-6位異戊烯基取代的化合物抑制活性更強;A環(huán)C-7位羥基甲基化也會顯著降低CYP1A1的抑制活性。見圖8。

圖7 異補骨脂查爾酮與CYP1A1的氨基酸殘基相結(jié)合的活性位點(A)、氫鍵作用(B)與疏水作用(C)

圖8 補骨脂異戊烯基成分對CYP1A1抑制活性的 結(jié)構(gòu)選擇性

4 討論

補骨脂是一種常用中藥,其富含的異戊烯基成分具有多種藥理活性,如抗骨質(zhì)疏松活性、雌激素受體樣作用等[4-7]。目前,多數(shù)研究集中在這些成分的體內(nèi)代謝物分析、藥動學(xué)特征及涉及CYP酶和UGT酶的代謝研究,這些研究表明,大量的肝腸首過效應(yīng)是這些補骨脂異戊烯基成分在體內(nèi)吸收快、暴露量低的重要原因[16-22]。極低的生物利用度(系統(tǒng)暴露量)使得這些成分很難達到體外的藥效濃度,這也給補骨脂藥效物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)增加了難度。

補骨脂富含的異戊烯基成分不僅可以被CYP酶和UGT酶等催化[20-23],同時還具有抑制CYP酶和UGT酶的活性[22,24-25]。本研究發(fā)現(xiàn),補骨脂異戊烯基成分對CYP1A1具有較強的抑制活性(IC50<5 μmol·L-1),這對于經(jīng)CYP1A1代謝的外源物來說,很容易誘發(fā)顯著的藥物-藥物相互作用。例如,利奧西呱及其主要代謝物是CYP1A1的強效抑制劑,與經(jīng)CYP1A1介導(dǎo)催化的藥物，如厄洛替尼或格拉司瓊臨床合用時需考慮相關(guān)的藥物-藥物相互作用[26]。同樣,在其他藥物與含補骨脂相關(guān)的中成藥聯(lián)合使用時,應(yīng)重點監(jiān)測可能出現(xiàn)的藥物-藥物相互作用。此外,CYP1A1還參與體內(nèi)雌激素水平的穩(wěn)態(tài)平衡[3],這也可能參與疾病的發(fā)生與發(fā)展。

為了評估可能存在的藥物-藥物相互作用,通常采用抑制劑在人血漿中的Cmax去獲得[I]/Ki值,[I]/Ki<0.1則認為出現(xiàn)藥物-藥物相互作用的可能性非常低,而[I]/Ki>1則表示非常有可能出現(xiàn)藥物-藥物相互作用,[I]/Ki在0.1～1之間,則認為有中等可能出現(xiàn)藥物-藥物相互作用[22]。然而到目前為止,關(guān)于補骨脂二氫黃酮、補骨脂定和異補骨脂查爾酮在人體內(nèi)的血藥濃度Cmax尚未見報道,因此限制了這種預(yù)測。然而在動物實驗中，大鼠灌胃給予補骨脂或者含補骨脂的中藥方劑后,3個成分的血藥濃度Cmax分別為0.003～0.037、0.003～0.078、0.005～1.08 μmol·L-1[16-19]。結(jié)合表1,當(dāng)單體給藥或大劑量提取物給藥時,血藥濃度增高，[I]/Ki>0.1,提示上述3種成分對CYP1A1全身代謝的抑制或清除作用影響較大,臨床上潛在的藥物-藥物相互作用風(fēng)險不容忽視。

補骨脂素同分異構(gòu)體及異補骨脂素的結(jié)構(gòu)類似物Bakuchicin對CYP1A表現(xiàn)出非常強的競爭性抑制(IC50和Ki值均小于0.50 μmol·L-1)[9]。本研究所選的5個化合物,僅有補骨脂定屬于香豆素類化合物,但和Bakuchicin在整體結(jié)構(gòu)上存在較大的差異(圖1)。盡管如此,2者均對CYP1A表現(xiàn)出較強的抑制活性。我們還發(fā)現(xiàn),補骨脂定對CYP1A1表現(xiàn)出非競爭性抑制動力學(xué),IC50值為0.49 μmol·L-1,Ki值為0.59 μmol·L-1(表1),這與文獻報道的有所差別[9],可能是由于這2個獨立的實驗選擇了不同的特異底物造成的。酶底物選擇不同,得到的抑制類型結(jié)果可能會有差異,這種現(xiàn)象在先前的研究也有報道,可能說明CYP1A1與底物存在2個或以上的結(jié)合位點[27]。

近年來,補骨脂及含補骨脂的中藥方劑,因其能顯著升高膽紅素和引發(fā)急性肝損傷等,受到越來越多的關(guān)注[28-29]。考慮到膽紅素在體內(nèi)經(jīng)UGT1A1代謝清除,而補骨脂富含的香豆素、異戊烯基成分等對UGT1A1具有顯著的抑制作用[22,24-25,27],因此,有學(xué)者認為補骨脂可能是由于對UGT1A1的顯著抑制導(dǎo)致膽紅素上升,誘發(fā)急性肝損傷[27]。本研究從補骨脂異戊烯基成分抑制CYP1A1活性入手,考慮到CYP1A1在雌激素代謝中的關(guān)鍵作用,以及雌激素在肝臟內(nèi)蓄積常引起膽汁淤積(雌激素類似物常用作膽汁淤積模型的化學(xué)誘導(dǎo)劑)[30],因此,補骨脂異戊烯基成分通過CYP1A1調(diào)節(jié)雌激素水平是一把雙刃劍,維持雌激素穩(wěn)態(tài)平衡對機體非常重要。

綜上所述,補骨脂富含的異戊烯基成分對CYP1A1表現(xiàn)出較強的抑制活性，其中補骨脂二氫黃酮、補骨脂定和異補骨脂查爾酮作用最強(IC50<0.5 μmol·L-1且Ki<0.6 μmol·L-1);分子對接結(jié)果也證明補骨脂二氫黃酮和異補骨脂查爾酮與CYP1A1具有較強的親和力，結(jié)合自由能分別為-10.145 kcal·mol-1和-8.286 kcal·mol-1,與α-萘黃酮(結(jié)合自由能為-10.861 kcal·mol-1)的抑制活性相當(dāng);最后,根據(jù)補骨脂異戊烯基成分的結(jié)構(gòu)位點,我們總結(jié)了不同位點與CYP1A1的親和力特征。上述結(jié)果為補骨脂的臨床合理使用與預(yù)防潛在的藥物-藥物相互作用風(fēng)險提供了實驗依據(jù)。