周楊,謝彤,時晨,康安,鄧海山,單進(jìn)軍

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)研究所,江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗室,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是各種肺內(nèi)外致病因素如嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、中毒、彌散性血管內(nèi)凝血等導(dǎo)致的急性彌漫性炎癥性肺損傷,以肺血管通透性增高、肺泡腔滲出富含蛋白質(zhì)的液體、肺水腫及透明膜的形成為主要病理特征,可迅速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征[1-3]。課題組前期對桔梗湯治療ALI進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)桔梗湯對ALI小鼠有一定的保護(hù)作用[4],但是其單味成分桔梗的作用機(jī)制尚不清楚。

代謝組學(xué)是組學(xué)領(lǐng)域的一大重要分支,主要用來研究各種小分子代謝物如氨基酸、脂肪酸等的動態(tài)變化,采用高通量的色譜、質(zhì)譜等技術(shù),結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,識別并定量生物樣本的代謝物,從而反映復(fù)雜生命體的整體功能[5-7]。近年來,代謝組學(xué)越來越多地運(yùn)用到中醫(yī)藥領(lǐng)域中,尤其是疾病機(jī)制的研究[8]。本實(shí)驗采用GC-MS技術(shù)分析桔梗給藥前后ALI小鼠血清代謝物及代謝通路的變化,研究桔梗預(yù)防ALI的潛在作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

24只雄性SPF級C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量18～22 g,購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(豫)2020-0005,于南京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心SPF級動物飼養(yǎng)房適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,溫度(22±2)℃,濕度(75±5)%,清潔飲水,晝夜控制各12 h。實(shí)驗動物使用許可證號:SYXK(蘇)2018-0049,所有動物實(shí)驗設(shè)計和方案均獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會同意和批準(zhǔn)(倫理批號:201909A036)。

1.2 藥物與試劑

桔梗(批號:101206)購于安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司;脂多糖(LPS,批號:0000081277)，甲氧胺鹽酸鹽(批號:BCBN2932V,純度:98%),吡啶(批號:STBD3537V,純度:99.8%),N-O-雙(三甲硅基)三氟乙酰胺(BSTFA,批號:BCBS4254V,純度:98.5%)，1,2-13C肉豆蔻酸(批號:SH2326V,純度:99%)均購于美國Sigma-Aldrich公司;正己烷(批號:4A6004,純度:95%)購于美國ROE公司;甲醇(批號:I880707710,純度:99.9%)購于德國Merck公司;實(shí)驗用水為娃哈哈純凈水;地塞米松片(批號：2004150211，規(guī)格:0.75 mg×100片)購于辰欣藥業(yè)股份有限公司;Trizol試劑(批號:252701)購于美國Thermo Fisher Scientific公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,見表1。

表1 引物序列

1.3 儀器

Trace1310-TSQ8000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher公司),TG-5MS毛細(xì)管色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm,美國Thermo Fisher公司),CPA225D型電子天平(德國Sartorius公司),Revco UXF型超低溫冰箱(美國Thermo Fisher公司),Vortex-Genie2渦旋振蕩儀(美國Scientific Industries公司),Allegra64R型離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司),SPD1010-230型離心濃縮儀(美國Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 桔梗水提液的制備

稱取桔梗藥材75.5 g,加水至0.9 L,浸泡30 min,先武火煮沸,再文火煎煮1.5 h,倒出藥液冷卻;再加入0.75 L水,先武火煮沸,再文火煎煮1 h,混合2次藥液,用紗布過濾,減壓濃縮至含生藥量為0.755 g·mL-1的桔梗水提液。

2.2 ALI模型的制備

24只SPF級C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥(地塞米松)組和桔梗組,每組6只。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,灌胃給藥,連續(xù)7 d,空白組、模型組給予生理鹽水10 mL·kg-1·d-1,陽性藥組給予相應(yīng)劑量的地塞米松混懸液10 mg·kg-1·d-1(取30片地塞米松片于研缽中研磨成粉末,裝入50 mL收集管中并加入22.5 mL娃哈哈純凈水配置成濃度為1 mg·mL-1的地塞米松混懸液),桔梗組給予7.55 g·kg-1·d-1的桔梗水提液。第7天給藥1 h后氣管滴注1 mg·mL-1LPS(3 mg·kg-1)造模,6 h后處死。

2.3 生物樣本的收集

血清樣本的收集:LPS造模6 h后,小鼠眼球取血,靜置0.5 h,4 000 r·min-1離心10 min,吸取上清于離心管中,-80 ℃冰箱備用。肺組織樣本的收集:眼球取血后,脫頸椎處死小鼠,解剖并采集左肺中葉用于病理檢測,同時稱取10 mg肺組織,用qPCR技術(shù)檢測肺組織相關(guān)炎癥指標(biāo)mRNA表達(dá)情況。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 肺組織HE染色 取用4%多聚甲醛溶液固定的肺組織,乙醇梯度脫水,2次二甲苯透明,石蠟包埋,切片,用蘇木精-伊紅染色,通過光鏡觀察肺組織病理變化。

2.4.2 肺組織相關(guān)炎癥指標(biāo)的檢測 稱取10 mg小鼠肺組織,采用Trizol法提取小鼠肺組織中總RNA,隨后將RNA反向轉(zhuǎn)錄為cDNA,貯存于-20 ℃?zhèn)溆?。對IL-1β、IL-6和TNF-α相關(guān)炎癥指標(biāo)進(jìn)行qPCR,每組重復(fù)3次實(shí)驗,采用2-ΔΔCt法計算樣本中mRNA相對表達(dá)。

圖1 小鼠肺組織病理(×200)

2.5 非靶向血清代謝組學(xué)的檢測方法

2.5.1 血清樣品前處理 將2.3項中獲得的血清樣品置于冰上融化,取50 μL樣品于含有200 μL甲醇溶液(含有12.5 μg·mL-1的1,2-13C肉豆蔻酸)的1.5 mL離心管中,渦旋5 min混勻,于4 ℃,18 000 r·min-1離心10 min,并取100 μL上清于另一干凈的1.5 mL離心管中,用離心濃縮儀(溫度:45 ℃,真空度:10 kPa)揮干。向揮干后的離心管中加入30 μL濃度為10 mg·mL-1甲氧胺吡啶溶液,渦旋5 min后置于恒溫震蕩儀中,30 ℃,300 r·min-1震蕩1.5 h;再加入30 μL BSTFA(含1%四甲基硅烷),混勻后置于恒溫震蕩儀中,37 ℃,300 r·min-1震蕩0.5 h。衍生化處理結(jié)束,4 ℃,18 000 r·min-1離心10 min,取50 μL上清于棕色進(jìn)樣小瓶內(nèi)進(jìn)樣分析。

2.5.2 血清質(zhì)控(QC)樣本制備 從24個樣本中各吸取10 μL。均勻混合后,吸取50 μL平行2次按照2.3項進(jìn)行前處理操作。

2.5.3 GC-MS分析條件 梯度升溫:0～1 min,60 ℃;1～14 min,60～320 ℃;14～19 min,320 ℃;分流模式:分流比20∶1;進(jìn)樣量:1 μL。電離方式:EI源;電離能:70 eV;離子源溫度:280 ℃;離子傳輸線溫度:250 ℃;質(zhì)譜采用全掃方式,掃描范圍:m/z50～500;載氣:高純度氦氣(純度>99.999%);氣流流速:1.2 mL·min-1。

2.5.4 數(shù)據(jù)處理 將GC-MS采集的圖譜信息,使用軟件MS-DIAL和NIST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行峰提取及物質(zhì)鑒定,得到代謝物名稱、組別、峰高組成的三維數(shù)據(jù)集。將數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Metaboanalyst 5.0(http://www.Metaboanalyst.ca/),對數(shù)據(jù)進(jìn)行總離子流歸一化、Log轉(zhuǎn)化及Pareto校準(zhǔn)后,進(jìn)行主成分分析(PCA),采用Wilcoxon檢驗和倍數(shù)差異(Foldchange),以P<0.05和Foldchange≥1.2或≤0.833 3為篩選條件獲得差異代謝物質(zhì)[4],用Metaboanalyst 5.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析及代謝通路分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 桔梗在體內(nèi)對LPS誘導(dǎo)的ALI有保護(hù)作用

如圖1所示,空白組小鼠的肺組織呈現(xiàn)正常形態(tài),支氣管腔內(nèi)無滲出物,肺泡壁未見增厚,周圍組織及管壁無炎性細(xì)胞浸潤。與空白組相比,模型組小鼠的肺形態(tài)出現(xiàn)異常,肺泡壁增厚,支氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死,腔內(nèi)見壞死細(xì)胞及大量滲出物,病變處結(jié)構(gòu)不清晰,出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤。陽性藥組和桔梗組的總體病變程度較模型組低,支氣管周圍出現(xiàn)部分炎細(xì)胞浸潤,肺形態(tài)有異常。

qPCR檢測結(jié)果如圖2所示,模型組中肺組織炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)水平較空白組有顯著增加(P<0.01，P<0.000 1),陽性藥組和桔梗組較模型組有顯著的下調(diào)(P<0.01，P<0.001，P<0.000 1),提示桔?？娠@著抑制ALI小鼠肺組織中促炎細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)。

注:與空白組比較,**P<0.01,****P<0.000 1;與模型組比較,圖2 肺組織炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)

3.2 血清非靶向代謝組學(xué)研究

3.2.1 小鼠血清GC-MS分析總離子流圖 血清樣本所得的總離子流色譜圖如圖3所示。圖中以最高色譜峰的離子強(qiáng)度為100%,圖中各譜峰之間分離度良好。使用MS-DIAL及NIST數(shù)據(jù)庫對色譜峰進(jìn)行化合物的鑒定,可以從GC-MS譜圖中鑒定得到115種代謝物,包括氨基酸、脂肪酸等小分子化合物。

3.2.2 小鼠血清代謝輪廓分析 如圖4A所示,QC樣品質(zhì)控分析序列穩(wěn)定性以及樣品的重復(fù)性好。圖4B中空白組、模型組、陽性藥組和桔梗組間的代謝輪廓能明顯區(qū)分,且分離程度好。經(jīng)桔梗干預(yù)后,ALI小鼠血清代謝輪廓向正常組靠近,表明內(nèi)源性代謝紊亂有所改善。桔梗對ALI有一定的預(yù)防作用。

注:A.空白組;B.模型組;C.陽性藥組;D.桔梗組圖3 小鼠血清樣本GC-MS總離子流圖

注:A.QC與血清樣本的PCA圖;B.各組小鼠血清樣品的PCA圖圖4 小鼠血清樣本PCA圖

3.2.3 差異代謝物和代謝通路富集 篩選出空白組與模型組31個差異代謝物,桔梗水提液可通過回調(diào)前13個代謝產(chǎn)物改善小鼠血清代謝輪廓,見表2。將空白組和模型組以及模型組和桔梗組血清中篩選的差異代謝物通過MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行代謝通路分析,以代謝通路富集分析P<0.05和代謝通路拓?fù)浞治龈患?Impact)>0.1為篩選條件,空白組和模型組共篩選得到4條相關(guān)代謝通路,模型組和桔梗組之間共篩選得到2條相關(guān)代謝通路,見圖5和表3。

表2 血清樣本差異代謝物

注:1.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝;2.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝;3.乙醛酸和二羧酸代謝;4.三羧酸循環(huán); A.模型組/空白組差異代謝物通路富集分析氣泡圖;B.桔梗組/模型組差異代謝物通路富集分析氣泡圖圖5 血清樣本差異代謝物通路富集分析氣泡圖

表3 血清樣本差異代謝物通路富集分析結(jié)果

4 討論

本研究從肺組織病理程度以及炎性因子mRNA的表達(dá)情況闡明了桔梗對ALI小鼠的預(yù)防作用。采用GC-MS技術(shù)檢測小鼠血清中代謝物的變化情況,分析3組小鼠血清中差異代謝物及其相關(guān)代謝通路,研究桔梗預(yù)防ALI的潛在作用機(jī)制。

通過空白組和模型組差異代謝物富集分析,得到4條具有統(tǒng)計學(xué)意義的代謝通路:甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸代謝通路,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路,乙醛酸和二羧酸代謝通路和三羧酸循環(huán)。同樣將模型組和桔梗組差異代謝物進(jìn)行富集分析得到2條具有統(tǒng)計學(xué)意義的代謝通路:甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸代謝通路和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路。發(fā)現(xiàn)甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝是兩者共有的通路,可以分析得到,桔梗可能通過調(diào)控ALI相關(guān)的代謝通路發(fā)揮預(yù)防ALI的作用。由表2可以看出桔梗給藥后回調(diào)最明顯的是甘氨酸,有研究報道具有肺功能障礙的人常伴有甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸等氨基酸水平的降低,用甘氨酸預(yù)處理LPS所致的ALI可減少LPS誘發(fā)的肺泡細(xì)胞凋亡、膠原蛋白沉積，降低趨化及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而減輕ALI[9-11]。甘氨酸是谷胱甘肽(GSH)合成的前體,GSH在體內(nèi)是一種重要的抗氧化劑,可以通過直接清除超氧化物和羥基自由基以及維持體內(nèi)氧化還原平衡來保護(hù)機(jī)體損傷[12-13]。Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)涉及保護(hù)肺和其他組織中氧化損傷基因的表達(dá)。有研究表明甘氨酸可以激活Nrf2信號,同時抑制NLRP3炎性體,發(fā)揮保護(hù)作用[14]。在LPS感染的小鼠中可以看出血清甘氨酸的水平明顯降低,桔梗給藥之后顯著回調(diào),這些結(jié)果表明桔梗的作用機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性代謝物的平衡,發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)和氧化活性的作用。天冬氨酸是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中重要的氨基酸之一,不僅可以參與蛋白質(zhì)合成,為蛋白質(zhì)合成提供原料,還可以作為賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸等氨基酸合成的前體。天冬氨酸在氨基酸降解中參與尿素循環(huán),該循環(huán)需要2個氨基,其中1個由天冬氨酸提供。在三羧酸循環(huán)中,天冬氨酸還可以幫助細(xì)胞質(zhì)中的NADH跨越線粒體膜,進(jìn)入線粒體基質(zhì)，對氧化磷酸化和能量產(chǎn)生來說是必需的[15-18]。這些途徑直接或間接參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)、能量代謝等調(diào)節(jié),表明桔梗的作用機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性代謝物的平衡,發(fā)揮著調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原平衡及能量代謝的作用。

綜上所述,桔梗對ALI小鼠有一定的預(yù)防作用。本研究利用非靶向代謝組學(xué)的方法分析桔梗對ALI小鼠血清中代謝物的改變,發(fā)現(xiàn)空白組小鼠的代謝物輪廓與ALI小鼠具有明顯差異,篩選出31個差異代謝物,桔梗通過作用于丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路改善ALI小鼠血清代謝物的紊亂，進(jìn)一步預(yù)防ALI。差異代謝物和其代謝通路的分析有利于深層次地研究ALI的發(fā)病機(jī)制,為臨床ALI的防治提供重要的理論依據(jù)。