周悅,馬曉斐,馬麗霞,張佳,莊欣雅,余亦婷,張倩,董潔,陳軍,嚴(yán)國俊

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

中藥固體制劑的體外溶出評(píng)價(jià)是制劑處方、工藝條件等一致性評(píng)價(jià)的可靠方法,也是制劑批內(nèi)、批間質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)的公認(rèn)方法[1]。與化學(xué)藥品質(zhì)量控制不同,對(duì)于中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的中藥,特別是復(fù)方制劑,藥效是由多種成分共同協(xié)作的結(jié)果,若以其中一種或幾種指標(biāo)性成分作為檢測(cè)對(duì)象,都難以反映中藥復(fù)方的整體性,也難以完全代表中藥制劑的質(zhì)量與藥效,因此有必要改善和更新固體制劑溶出度的考察標(biāo)準(zhǔn)和方法[2-3]。而生物活性檢測(cè)是一步到位直接考察藥物安全性與有效性的質(zhì)量控制方法,以生物效價(jià)作為中藥溶出度的檢測(cè)方法已經(jīng)成為研究發(fā)展的新趨勢(shì)[4-6]。

生物活性測(cè)定法從中藥的生物效應(yīng)出發(fā),能夠反映中藥的臨床活性,可以用于中藥的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)以復(fù)方丹參片為模型藥,依據(jù)大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)對(duì)復(fù)方丹參片不同時(shí)間的溶出液呈現(xiàn)濃度梯度依賴[7],利用RTCA技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同時(shí)間溶出藥液的細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化[8],獲得時(shí)間劑量依賴性細(xì)胞反應(yīng)曲線(Time-dose-dependent cell response curves,TCRPs),建立一種以細(xì)胞指數(shù)(Cell index，CI)為指標(biāo)的細(xì)胞生物效應(yīng)溶出動(dòng)力學(xué)模型,并與紫外分光光度法檢測(cè)的溶出度結(jié)果進(jìn)行相似性評(píng)價(jià)。該法從中藥的整體效應(yīng)出發(fā),彌補(bǔ)了化學(xué)成分與臨床療效或毒性關(guān)聯(lián)性小的缺陷,對(duì)于中藥固體制劑溶出度評(píng)價(jià)研究提供了新的方法,也為中藥的質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

85-2型恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);RC-3溶出度測(cè)試儀(天津新天光公司);UV-2401紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);FA1104N型電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);MZY-U20V超純水機(jī)(南京妙之儀電子科技有限公司);RTCA實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀(杭州艾森生物有限公司);Sorvall ST16R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī);Sorvall ST16R臺(tái)式低速離心機(jī)(美國Thermo公司);3111型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);渦旋振蕩儀(美國Bio-Rad公司);ECLIPSE Ti-S型倒置顯微鏡(日本Nikon公司);1300 SERIES A2生物安全柜(美國Thermo公司)。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方丹參片(云南白藥基團(tuán)股份有限公司,批號(hào):ZMC1712);復(fù)方丹參片(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司,批號(hào):J19A004);復(fù)方丹參片(廣西藥用植物園制藥廠,批號(hào):180501-066);鹽酸(AR,萊陽精細(xì)化工廠,批號(hào):20110219);胰蛋白酶溶液(Gibco公司);RTCA板(杭州艾森生物有限公司);DMEM培養(yǎng)基(Corning公司)。

1.3 細(xì)胞

大鼠心肌細(xì)胞(H9C2細(xì)胞)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.4 復(fù)方丹參片溶出度供試樣品的制備

1.4.1 不同溶出時(shí)間樣品 取空白人工胃液1 000 mL置于溶出杯中,加熱至37 ℃,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)籃轉(zhuǎn)速為100 r·min-1,將精密稱定質(zhì)量的復(fù)方丹參片分別放入轉(zhuǎn)籃內(nèi),以空白人工胃液接觸藥片時(shí)為零時(shí)刻開始計(jì)時(shí),按10、20、30、40、50、60、70、80 min定時(shí)取樣,每次取樣10 mL(立即補(bǔ)充同溫同體積的空白人工胃液)用微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液即得。

1.4.2 完全溶出樣品 另取復(fù)方丹參片10片,精密稱定,計(jì)算出平均片質(zhì)量(W),將稱定的片劑研細(xì),再精密稱取相當(dāng)于W的量,置1 000 mL燒杯中,置于恒溫磁力攪拌器上,向燒杯內(nèi)加入1 000 mL空白人工胃液,并以藥片粉末接觸人工胃液零時(shí)刻開始計(jì)時(shí),在(37.0±0.5) ℃水浴中均勻攪拌2 h,取10 mL用微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液即得。

1.5 大鼠心肌H9C2細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇的H9C2細(xì)胞置于飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞至85%融合度時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化傳代,倒置顯微鏡中觀察,取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,1 000 r·min-1離心5 min,計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104mL-1用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 基于RTCA復(fù)方丹參片生物效應(yīng)溶出度的測(cè)定

2.1.1 復(fù)方丹參片生物效應(yīng)溶出方法學(xué)考察

2.1.1.1 精密度試驗(yàn) 取適量復(fù)方丹參片,置于研缽內(nèi)搗碎,精密稱取10、15、20 mg分別加入1 mL人工胃液中充分溶解,配制成10、15、20 mg·mL-1的儲(chǔ)備液。經(jīng)過稀釋后,配成終濃度為0.6、1.0、1.4 mg·mL-1的藥液。將0.6、1.0、1.4 mg·mL-13種樣品分別在RTCA儀器中進(jìn)樣6次,同時(shí)監(jiān)測(cè)這3種質(zhì)量濃度的樣品作用于細(xì)胞產(chǎn)生的CI值。經(jīng)數(shù)據(jù)分析,計(jì)算得出每種樣品的RSD。結(jié)果表明,3種質(zhì)量濃度的樣品在 0～64.24 h內(nèi)細(xì)胞指數(shù)的RSD均小于3.0%,說明在0～64.24 h時(shí)間段精密度良好。

2.1.1.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方丹參片適量,置于研缽內(nèi)搗碎,精密稱取15 mg,平行6份,用1 mL人工胃液溶解,分別配制成儲(chǔ)備液15 mg·mL-1,再進(jìn)行稀釋最終配成濃度為1.0 mg·mL-1的藥液,分別進(jìn)樣,進(jìn)行細(xì)胞指數(shù)的測(cè)定,計(jì)算出6份平行樣品在不同時(shí)間點(diǎn)的RSD。結(jié)果表明,樣品在0～48.23 h內(nèi)細(xì)胞指數(shù)的RSD均小于3.0%,說明在0～48.23 h時(shí)間段重復(fù)性良好。

經(jīng)過復(fù)方丹參片生物溶出方法學(xué)的考察,綜合數(shù)據(jù)可知,0～48 h是細(xì)胞指數(shù)最佳的選擇范圍。

2.1.2 基于RTCA測(cè)定不同時(shí)間溶出樣品的TCRPs 在細(xì)胞檢測(cè)板的每個(gè)小孔中先加入50 μL生長介質(zhì),再加入密度為2×104mL-1的特定細(xì)胞懸液100 μL。將此細(xì)胞檢測(cè)板在室溫下放置30 min后,放到培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。20～24 h后,當(dāng)細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定時(shí),取H9C2細(xì)胞的細(xì)胞檢測(cè)板,除對(duì)照組外,換液并向每孔中加入“1.4”項(xiàng)下的不同時(shí)間點(diǎn)的溶出藥液樣品和完全溶出樣品50 μL,每個(gè)溶出樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將加好樣的檢測(cè)板放入實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析儀中,繼續(xù)檢測(cè)72 h,測(cè)得各樣品溶液作用于H9C2細(xì)胞后所產(chǎn)生的細(xì)胞指數(shù),從而獲得各個(gè)樣品的TCRPs曲線(圖1～3)。

圖1 批號(hào)ZMC1712復(fù)方丹參片溶出樣品的TCRPs曲線

圖2 批號(hào)J19A004復(fù)方丹參片溶出樣品的TCRPs曲線

圖3 批號(hào)180501-066復(fù)方丹參片溶出樣品的TCRPs曲線

由不同時(shí)間溶出樣品的TCRPs曲線數(shù)據(jù)可知,加入不同時(shí)間溶出樣品后細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不同趨勢(shì)的生長狀態(tài)變化,加藥前CI穩(wěn)定上升,加藥后不同樣品的CI出現(xiàn)大幅度的變化,溶出時(shí)間短的樣品組CI呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢(shì),溶出時(shí)間長的樣品組CI持續(xù)下降。不同廠家的TCRPs曲線之間存在較大差異,加藥后呈現(xiàn)穩(wěn)定濃度梯度依賴性,選取各時(shí)間段RSD值最小進(jìn)行分析。批號(hào)ZMC1712復(fù)方丹參片在加藥后20.39～22.31 h時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞指數(shù)呈現(xiàn)穩(wěn)定的質(zhì)量濃度梯度依賴性,因此選取該段為分析的最佳時(shí)間段;批號(hào)180501-066復(fù)方丹參片在加藥后24.36～26.40 h時(shí)間段內(nèi)呈現(xiàn)穩(wěn)定的質(zhì)量濃度梯度依賴性,故選取該段為分析的最佳時(shí)間段;而批號(hào)J19A004復(fù)方丹參片在加藥后,不同溶出時(shí)間樣品之間的TCRPs曲線會(huì)出現(xiàn)短暫的交錯(cuò)狀態(tài),在32.14～34.14 h時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞指數(shù)也呈現(xiàn)出穩(wěn)定的質(zhì)量濃度梯度依賴性,因此選取該段為分析的最佳時(shí)間段。

圖4 不同廠家復(fù)方丹參片的生物效價(jià)溶出度曲線

2.1.3 不同時(shí)間溶出樣品的生物效價(jià)溶出度 選取具有穩(wěn)定質(zhì)量濃度梯度的細(xì)胞指數(shù)-溶出時(shí)間曲線,進(jìn)行溶出度(Q)的計(jì)算,結(jié)果見表1～3。根據(jù)溶出度結(jié)果繪制不同批號(hào)的復(fù)方丹參片生物效價(jià)溶出曲線,見圖4。

Q=(CIi-CIck)/(CI0-CIck)

CIi指各時(shí)間點(diǎn)溶出樣品的CI值,CIck指不加藥物時(shí)的CI值,CI0指藥物完全溶出時(shí)的CI值。

2.2 利用紫外分光光度法測(cè)定復(fù)方丹參片溶出度

2.2.1 檢測(cè)波長的選擇 復(fù)方丹參片在(282±2) nm處有最大吸收[9],采用“1.4.2”項(xiàng)下復(fù)方丹參片完全溶出樣品在200～400 nm處檢測(cè),在283 nm處有最大吸收,見圖5,故選定283 nm為檢測(cè)波長。

2.2.2 線性關(guān)系考察 量取“1.4.2”項(xiàng)下復(fù)方丹參片完全溶出樣品適量,用人工胃液稀釋成相對(duì)溶出量90%、70%、50%、30%、20%、10%的濃度系列,以人工胃液為空白,測(cè)定283 nm波長下的A值。以相對(duì)溶出量為橫坐標(biāo)(X),A值為縱坐標(biāo)(Y),計(jì)算回歸方程,回歸方程為Y=0.024 2X-0.006 8,r=0.999 6。

圖5 復(fù)方丹參片完全溶出樣品的UV吸收光譜

表1 批號(hào)ZMC1712復(fù)方丹參片不同溶出時(shí)間點(diǎn)樣品的CI值

表2 批號(hào)J19A004復(fù)方丹參片不同溶出時(shí)間點(diǎn)樣品的CI值

表3 批號(hào)180501-066復(fù)方丹參片不同溶出時(shí)間點(diǎn)樣品的CI值

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 量取適量相對(duì)溶出量為50%的溶液,分別在0、2、4、8、10、12、24 h測(cè)定A值,考察溶液穩(wěn)定性,結(jié)果RSD為1.81%,表明藥液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 量取適量復(fù)方丹參片完全溶出的藥液,重復(fù)測(cè)定6次,記錄下A值,求得樣品的RSD為0.84%,表明該儀器精密度良好。

2.2.5 溶出度的測(cè)定 每次精密稱取復(fù)方丹參片1片的質(zhì)量為Wi,并按照“1.4.1”項(xiàng)下制備10、20、30、40、50、60、70、80 min的復(fù)方丹參片溶出樣品微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液用紫外可見分光光度計(jì)于283 nm處測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)溶出樣品的A值(Ai);取復(fù)方丹參片10片,精密稱定,計(jì)算出平均片質(zhì)量(W),將稱定的片劑研細(xì),再精密稱取相當(dāng)于W的量,并按照“1.4.2”項(xiàng)下制備完全溶出樣品,微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液用紫外可見分光光度計(jì)于283 nm處測(cè)定A值(A0);按公式計(jì)算溶出度(Q),Q=(WAi/WiA0)×100%，結(jié)果見表4。根據(jù)結(jié)果繪制3個(gè)廠家的復(fù)方丹參片UV溶出度曲線,見圖6。

表4 不同批號(hào)復(fù)方丹參片的紫外分光光度法溶出度結(jié)果

圖6 不同廠家復(fù)方丹參片的UV溶出度曲線

2.3 考察復(fù)方丹參片生物效應(yīng)溶出曲線與紫外溶出曲線的相關(guān)性

2.3.1 差異因子f1與相似因子f2差異因子f1是計(jì)算在每一時(shí)間點(diǎn)2個(gè)曲線差異的百分率(%),是2條曲線相對(duì)誤差的衡量參數(shù);相似因子f2為對(duì)偏差的平方和的平方根的倒數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換,為2條曲線溶出百分率(%)相似性的衡量參數(shù)。一般情況下,當(dāng)差異因子f1值≤15且相似因子f2值≥50,則認(rèn)為2條溶出曲線相似,反之,則認(rèn)為不相似[10]。公式中Rt和Tt分別代表參比制劑和受試制劑在時(shí)間t的釋放度,n為時(shí)間點(diǎn)的個(gè)數(shù)(公式如下)。

圖7 不同廠家復(fù)方丹參片生物效價(jià)溶出曲線 與紫外溶出曲線

利用DDSolver軟件[11],以紫外溶出曲線作為參比制劑,生物效價(jià)溶出曲線作為受試制劑,將對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)輸入軟件,可快速獲得3批復(fù)方丹參片生物效價(jià)溶出曲線與紫外溶出曲線的差異因子f1和相似因子f2的結(jié)果,2種方法的溶出曲線見圖7。

經(jīng)分析,批號(hào)ZMC1712、批號(hào)J19A004和批號(hào)180501-066復(fù)方丹參片生物效價(jià)溶出曲線與紫外溶出曲線的差異因子f1分別為12.08、8.17和7.30,均小于15;相似因子f2分別為55.97、62.49和61.61,均大于50。結(jié)果表明同一廠家的復(fù)方丹參片生物效價(jià)溶出曲線與紫外溶出曲線基本相似。

2.3.2 溶出動(dòng)力學(xué)模型擬合 目前常用的溶出速率模型有零級(jí)模型、一級(jí)模型、Weibull模型等,其中零級(jí)模型考察是否恒速釋藥,一級(jí)模型考察是否非恒速釋藥,Weibull模型幾乎適用于所有溶出曲線。采用DDSolver軟件對(duì)2種評(píng)價(jià)方法下的溶出曲線進(jìn)行零級(jí)模型、一級(jí)模型及Weibull模型擬合,擬合結(jié)果見表5。并求出各批次最佳模型的溶出參數(shù),累積釋放率T25,用于考察藥物是否有突釋;T50和Td用于確定藥物的釋藥特性;T80用于考察釋藥是否基本完全,結(jié)果見表6～7。

表5 復(fù)方丹參片溶出模型擬合結(jié)果

表6 批號(hào)ZMC1712和180501-066復(fù)方丹參片

表7 批號(hào)J19A004復(fù)方丹參片零級(jí)模型擬合溶出參數(shù)

從擬合結(jié)果看,批號(hào)ZMC1712和180501-066復(fù)方丹參片紫外分光光度法與生物效價(jià)的溶出曲線均對(duì)Weibull模型擬合度更佳;批號(hào)J19A004復(fù)方丹參片紫外分光光度法與生物效價(jià)的溶出曲線的最佳擬合模型為零級(jí)速率模型,說明其溶出規(guī)律為恒速釋藥。結(jié)果表明不同廠家之間最佳擬合模型不一致,不同廠家之間存在質(zhì)量差異。最佳模型的溶出參數(shù)結(jié)果可知,各批號(hào)的復(fù)方丹參片無突釋情況;同一廠家2種評(píng)價(jià)方法下的T50和Td差異性并不大;T80基本完全溶出時(shí)間比較:批號(hào)J19A004>批號(hào)180501-066>批號(hào)ZMC1712,批號(hào)J19A004復(fù)方丹參片完全溶出最慢,而批號(hào)ZMC1712復(fù)方丹參片完全溶出最快。

由上述紫外吸收和細(xì)胞生物效應(yīng)為指標(biāo)的溶出度差異可看出,不同廠家生產(chǎn)的同一規(guī)格的復(fù)方丹參片,其體外溶出行為差異較大,可推斷其體內(nèi)釋放行為和藥效差異也不可避免的具有差異,一致性較差。中藥制劑的質(zhì)量一致性影響因素眾多,與中藥原料、飲片炮制、提取純化工藝,成型輔料及工藝等都密切相關(guān),需要全過程標(biāo)準(zhǔn)化控制,保障中藥品質(zhì)完整一致的傳遞,最終才可形成質(zhì)量和療效一致的中藥制劑。

4 討論

溶出度試驗(yàn)是中藥固體制劑質(zhì)量控制的有效手段,但評(píng)價(jià)方法常以單一或多個(gè)活性成分作為研究對(duì)象,未能體現(xiàn)中藥多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特征,并不能獲得中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的完整參數(shù),缺乏科學(xué)性與整體性。若以單一的化學(xué)成分溶出曲線衡量固體制劑的質(zhì)量仍然可能存在不足,甚至?xí)c藥物的真正療效出現(xiàn)偏離。生物效應(yīng)評(píng)價(jià)法是繼性狀評(píng)價(jià)、化學(xué)評(píng)價(jià)之后,推動(dòng)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)走進(jìn)臨床、關(guān)聯(lián)療效的有效途徑和手段,特別適用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜或理化方法不能測(cè)定其含量,或者理化測(cè)定不能反映其臨床生物活性的藥物,主要表現(xiàn)在具有較強(qiáng)的專屬性、直接關(guān)切中藥有效性與安全性、簡單快速,符合中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀,在中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。該方法可以在不以化學(xué)成分為目標(biāo)的基礎(chǔ)上,從整體出發(fā),對(duì)中藥固體制劑進(jìn)行溶出動(dòng)力學(xué)的評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)以復(fù)方丹參片作為多成分的化學(xué)集合體,將此集合體作用于H9C2細(xì)胞群落,藥物作用于細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生可定量的電信號(hào),利用RTCA實(shí)時(shí)檢測(cè)獲得CI,并得到以CI為指標(biāo)的生物效應(yīng)溶出曲線。與傳統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞增長率的方法比較,RTCA具有動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)、高效、免標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn),能真實(shí)反映藥物作用于細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程。

與單個(gè)或多個(gè)化學(xué)成分評(píng)價(jià)相比,紫外光譜將中藥或中藥復(fù)方的各類化學(xué)成分相互疊加,是化學(xué)成分相互作用的總和,一定程度上可以反映中藥的“整體”信息。結(jié)果顯示,不同廠家復(fù)方丹參片溶出樣品之間的TCRPs曲線具有差異性,不同廠家之間的生物效價(jià)溶出曲線也有明顯區(qū)別。相似因子法便于計(jì)算,但未考慮數(shù)據(jù)的變異性,易受溶出時(shí)間點(diǎn)數(shù)目的影響,具有一定的局限性。因此補(bǔ)充了差異因子法和模型依賴法,對(duì)2種評(píng)價(jià)方法進(jìn)行相似性研究。將生物效應(yīng)評(píng)價(jià)法與紫外分光光度法的溶出結(jié)果進(jìn)行比較,同一廠家的復(fù)方丹參片生物效價(jià)溶出曲線與紫外溶出曲線均具有相似性,且最佳擬合模型一致;不同廠家之間最佳擬合模型不一,且溶出參數(shù)存在差異,與紫外分光光度法溶出結(jié)果一致,生物效應(yīng)評(píng)價(jià)法也可以說明不同生產(chǎn)廠家之間質(zhì)量存在差異性,結(jié)果表明基于RTCA建立的復(fù)方丹參片細(xì)胞指數(shù)溶出度模型具有可行性。從中藥的生物效應(yīng)出發(fā),建立符合中醫(yī)整體觀的中藥固體制劑細(xì)胞生物效應(yīng)溶出度評(píng)價(jià)方法,可以彌補(bǔ)單一化學(xué)成分評(píng)價(jià)的缺陷,保證質(zhì)量與有效性一致,為中藥復(fù)方制劑的一致性評(píng)價(jià)提供新的思路和方法。