徐文韜,姜思媛,常思琦,張智慧,宋揚揚,張新昌,倪光夏

(南京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院·養(yǎng)生康復學院,江蘇 南京 210023)

早期實施靜脈溶栓是目前公認的治療急性腦梗死的首選方案[1]。在腦梗死發(fā)生的超早期進行阿替普酶(rt-PA)溶栓治療,可有效改善患者的神經(jīng)功能。但該療法的使用,有著嚴格的時間窗(3～4.5 h)[2]限制,一旦超過溶栓時間窗,溶栓治療的效果會大幅度降低,同時會破壞血腦屏障(Blood brain barrier,BBB),增加出血性轉(zhuǎn)化、腦水腫等溶栓并發(fā)癥的發(fā)生率[3]。然而在現(xiàn)實生活中由于受到多種因素的影響,要在規(guī)定的時間窗內(nèi)進行溶栓治療難度極大。本課題組前期研究結(jié)果初步表明:用針刺早期介入到腦梗死溶栓治療中,可通過非Caspase通路抑制細胞凋亡,延長溶栓時間窗,從而提高溶栓安全性[4]?，F(xiàn)有研究表明,星形膠質(zhì)細胞是BBB組成之一,其活化標記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、水通道蛋白-4(AQP-4)在腦損傷發(fā)生過程中的作用不容忽視,且針刺腦保護效應的發(fā)揮與調(diào)控星形膠質(zhì)細胞活化程度密切相關(guān)[5-7]。但針刺能否通過調(diào)控星形膠質(zhì)細胞活化,減少腦梗死溶栓后BBB的破壞來提高溶栓安全性,目前還缺少深入探索。

本實驗在溶栓治療基礎上配合針刺,論證及時針刺干預的作用,并從星形膠質(zhì)細胞的途徑探討其可能的機制,為臨床針刺提高溶栓安全性提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠114只,體質(zhì)量(300±20)g,由浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,實驗動物許可證號:SCXK(浙)2019-0001。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心,溫度20～22 ℃,相對濕度40%～50%,自由攝食飲水。實驗通過南京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查,批準號:201906A024。

1.2 藥物、試劑與儀器

注射用rt-PA(德國Boehringer Ingelheim,批號:901027),凝血酶(美國Sigma,貨號:T4648-1KU),TTC(美國Sigma,貨號:T8877-50G),EB(美國Sigma),BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(南京碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號:P0010),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,貨號:11123ES60],qPCR試劑盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,貨號:11202ES08],GFAP抗體(美國Affinity,貨號:AF6166),GAPDH抗體(美國Affinity,貨號:AF7021),AQP-4抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,貨號:16473-1-AP),β-tubulin抗體[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,貨號:30302ES20],山羊抗兔IgG(美國Abcam,貨號:ab150080)。

酶標儀(美國Bio-Tek,Synergy H1),垂直電泳系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)膜儀、制膠器(美國Bio-Rad),實時熒光定量PCR儀(美國Stratagene,MX3000P),化學發(fā)光成像儀(上海歐翔科學儀器有限公司,Bioshine ChemiQ 4800mini),激光多普勒血流儀(英國Moor,MoorVMS-LDF1),高速離心機、電動勻漿器、移液槍(德國Eppendorf)。

2 方法

2.1 實驗分組

66只大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后,采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、4.5 h溶栓組、6 h溶栓組、針刺+4.5 h溶栓組、針刺+6 h溶栓組,每組11只。

2.2 模型制備

大鼠麻醉后,俯臥位固定于手術(shù)臺上,頭部脫毛并常規(guī)消毒。矢狀位剪開頂部皮膚約1 cm,分離皮下筋膜,直至暴露前囟和顱骨。使用顱骨鉆在右側(cè)顱骨打1個小孔,以穿透顱骨但未穿透硬腦膜為宜。使用特制膠水(LOCTITE7452、LOCTITE411)將激光多普勒血流儀的探頭固定于腦膜,觀察大腦中動脈供血區(qū)右側(cè)大腦皮質(zhì)的局部腦血流量(RCBF),當所示數(shù)值平穩(wěn)后,記錄此時RCBF值并定義為基線(100%)。

圖1 凝血酶誘導的改良PE-50導管制備自體血栓

參照團隊前期制備大鼠自體血栓栓塞性模型的方法[8],先制備自體血栓,將凝血酶和大鼠眼眶靜脈血吸入毛細玻璃管中,靜置2 h后取出血栓,用注射器吸入PE-50導管中備用(見圖1)。將上述大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上,大鼠體位變動會造成RCBF變化,等數(shù)值稍穩(wěn)定再行頸部手術(shù)。切開頸部正中皮膚,鈍性分離右側(cè)頸總動脈(RCCA)、頸外動脈(RECA)、頸內(nèi)動脈(RICA)及翼腭動脈。結(jié)扎RECA遠心端,在其近心端打活結(jié)備用,動脈夾暫時夾閉RCCA近心端和RICA。在RECA上近分叉處剪一小口,經(jīng)此小口處插入制備好的PE-50導管尖端,拉緊備用活結(jié)以固定導管,移去RICA上的動脈夾,經(jīng)分叉處將PE-50導管緩慢向RICA入顱腦方向推進19～22 mm,當導管尖端到達大腦中動脈(MCA)的起始處時,先將導管撤回1～2 mm,再將PE-50導管中的血栓推入MCA。拔出導管,結(jié)扎RECA,松開RCCA上的動脈夾,消毒并縫合頸部切口。觀察RCBF數(shù)值變化,當數(shù)值基本穩(wěn)定保持于基線的20%～30%來初步認定造模成功。最后進行頭部切口縫合。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng),注意保暖。假手術(shù)組只進行鈍性分離。術(shù)后2 h大鼠蘇醒,神經(jīng)行為學評分為2～4分的大鼠正式入模[9-10]。

2.3 干預方法

2.3.1 針刺干預方法 針刺+溶栓組大鼠于造模后2 h給予針刺干預,并在相應時間點(造模后4.5、6 h)進行溶栓治療。取穴:選取“醒腦開竅”針刺法主穴雙側(cè)內(nèi)關(guān)、水溝。針刺方法:選用華佗牌針灸針(0.18 mm×13.0 mm),向鼻中隔方向斜刺水溝穴2～3 mm,采用雀啄手法行針1 min,留針30 min;直刺內(nèi)關(guān)穴,深度為3 mm,行提插捻轉(zhuǎn)瀉法1 min,留針30 min。

2.3.2 溶栓方法 溶栓組大鼠在造模后相應時間點(4.5、6 h),將rt-PA稀釋后按10 mg·kg-1經(jīng)尾靜脈緩慢注入。

2.4 Bederson法進行神經(jīng)行為學評分

評分標準參考Bederson 6級5分法[9-10],對各組大鼠分別于造模后2 h和24 h各評分1次。無明顯神經(jīng)功能損傷癥狀為0分;對側(cè)前肢無法完全伸直為1分;拉尾時,對側(cè)前肢抓力下降為2分;可在所有方向上自發(fā)運動,只有在拉尾時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為3分;自發(fā)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為4分;死亡為5分。

2.5 TTC染色法檢測腦梗死體積百分比

各組取5只大鼠于造模后24 h麻醉處死,冰上剝離大腦,去除嗅球、小腦和腦干,將腦組織置于-30 ℃冰箱快速冷凍15 min后切成厚度均勻的8片。將腦切片置于2%TTC染色液中,避光,37 ℃恒溫孵育15 min,期間翻動腦片1～2次。染色后正常腦組織為紅色,梗死區(qū)域為白色。小心將腦切片置于深色背景上,按順序排列,紙巾吸取周圍多余染色液。相機拍攝后輸入計算機,運用Image J圖像處理軟件計算，腦梗死體積百分比=梗死體積/全腦體積×100%。

2.6 EB滲透法測定BBB通透性

各組取3只大鼠,處死前2 h尾靜脈注射2%EB溶液(0.4 mL·100 g-1),循環(huán)2 h后心臟灌注250 mL提前預冷的生理鹽水,當右心房流出的液體變清澈以及肝臟、四肢變白即可取材。將大腦切成左右兩半,濾紙吸干表面水分并稱質(zhì)量。將稱質(zhì)量后的右側(cè)大腦半球浸入甲酰胺(1 mL·100 mg-1),隨后進行勻漿。60 ℃水浴箱中孵育24 h,以13 000 r·min-1的速度離心20 min,小心取得上清液。利用酶標儀,在620 nm波長處測量吸光度。根據(jù)EB標準曲線,獲取上清液中EB的含量。

2.7 干濕質(zhì)量法測定腦含水量

各組取3只大鼠,造模后4 h麻醉處死,冰上剝離大腦,去除嗅球、小腦及腦干,將大腦切成左右兩半,濾紙吸干表面水分。稱取右側(cè)大腦半球質(zhì)量(濕質(zhì)量),隨后將其放入100 ℃烤箱中干燥,并在24 h后再次稱取右側(cè)半球質(zhì)量(干質(zhì)量)。根據(jù)公式:腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

2.8 機制研究

2.8.1 實驗分組、模型制備與干預方法 48只大鼠被隨機分為假手術(shù)組、模型組、6 h溶栓組、針刺+6 h溶栓組,每組12只。造模和干預方法同2.2、2.3。

2.8.2 標本采集 造模后24 h麻醉處死動物,冰上剝離右側(cè)大腦半球梗死皮層區(qū)域,迅速置于凍存管中,移至-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.8.3 qPCR檢測大腦皮層中GFAP、AQP-4 mRNA表達 Trizol法提取大腦皮層總RNA，分光光度計檢測總RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄(20 μL體系)獲得cDNA后,實時熒光定量PCR儀進行擴增。擴增條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,40個循環(huán)。引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成,引物序列見表1。反應結(jié)束后,以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法分析mRNA相對表達量。

表1 引物序列

2.8.4 Western blot檢測大腦皮層中GFAP、AQP-4蛋白表達 采用RIPA蛋白裂解液提取大腦皮層總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。蛋白定量后,配置SDS-PAGE進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加入一抗:GFAP一抗(1∶1 000)、AQP-4一抗(1∶2 000)、β-tubulin一抗(1∶5 000)、GAPDH一抗(1∶5 000),4 ℃孵育過夜。次日洗滌后加入羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h,充分洗滌,化學發(fā)光,顯影,定影。通過Image J軟件處理得到各蛋白的目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值。每組實驗重復2次。

2.9 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 模型制備過程中腦血流變化

模型制備過程中,右側(cè)腦血流波動變化,主要分為3個階段。①造模前,鈍性分離右側(cè)RCCA、RECA、RICA,腦血流水平雖有所波動但總體維持在較高水平;②夾閉右側(cè)RCCA及RICA后,腦血流突然下降,之后大體保持平穩(wěn);③注射血栓,堵塞MCA后,腦血流將進一步下降,當數(shù)值基本穩(wěn)定保持于初始值的20%～30%時,初步認為造模成功。見圖2。

圖2 模型制備過程中腦血流變化

3.2 針刺對腦梗死大鼠溶栓后神經(jīng)行為學評分的影響

造模后2 h神經(jīng)行為學評分結(jié)果顯示:假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損情況,其余各組評分均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01),干預各組與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模后24 h神經(jīng)行為學評分結(jié)果顯示:模型組大鼠的神經(jīng)行為學評分明顯高于假手術(shù)組(P<0.01);4.5 h溶栓組與針刺+4.5 h溶栓組大鼠的神經(jīng)行為學評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),均明顯低于模型組(P<0.01);與模型組、6 h溶栓組相比,針刺+6 h溶栓組大鼠的神經(jīng)行為學評分均明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見圖3。

注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與6 h溶栓組比較,圖3 各組大鼠造模后2 h和24 h神經(jīng)行為學評分比較

3.3 針刺對腦梗死大鼠溶栓后腦梗死體積百分比的影響

模型組大鼠腦梗死體積百分比明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。4.5 h溶栓組與針刺+4.5 h溶栓組大鼠的腦梗死體積百分比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),均顯著低于模型組(P<0.01)。與模型組、6 h溶栓組相比,針刺+6 h溶栓組大鼠的腦梗死體積百分比均明顯降低(P<0.05)。見圖4～5。

圖4 各組大鼠TTC染色圖

注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05, ##P<0.01;與6 h溶栓組比較,

3.4 針刺對腦梗死大鼠溶栓后BBB通透性的影響

模型組大鼠的EB含量明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。4.5 h溶栓組與針刺+4.5 h溶栓組大鼠的EB含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),均明顯低于模型組(P<0.01)。與模型組相比,6 h溶栓組大鼠的EB含量升高(P<0.01),針刺+6 h溶栓組大鼠的EB含量降低(P<0.01)。針刺+6 h溶栓組大鼠的EB含量明顯低于6 h溶栓組(P<0.01)。見圖6～7。

圖6 各組大鼠EB圖

注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01; 與6 h溶栓組比較,

3.5 針刺對腦梗死大鼠溶栓后腦含水量的影響

模型組大鼠的腦含水量明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。4.5 h溶栓組與針刺+4.5 h溶栓組大鼠的腦含水量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),均明顯低于模型組(P<0.01)。與模型組相比,6 h溶栓組大鼠的腦含水量升高(P<0.01),針刺+6 h溶栓組大鼠的腦含水量降低(P<0.05)。針刺+6 h溶栓組大鼠的腦含水量明顯低于6 h溶栓組(P<0.01)。見圖8。

3.6 針刺對腦梗死大鼠溶栓后大腦皮層GFAP、AQP-4 mRNA表達的影響

本研究已經(jīng)證實針刺可將安全溶栓時限提高到6 h,因此選用6 h溶栓組進行后續(xù)機制研究。模型組大鼠大腦皮層GFAP、AQP-4的mRNA表達水平均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。與模型組相比,6 h溶栓組大鼠大腦皮層GFAP、AQP-4的mRNA表達水平升高,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組、6 h溶栓組相比,針刺+6 h溶栓組大鼠大腦皮層GFAP、AQP-4的mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)。見圖9。

注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05, ##P<0.01;與6 h溶栓組比較,

注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01; 與6 h溶栓組比較,

3.7 針刺對腦梗死大鼠溶栓后大腦皮層GFAP、AQP-4蛋白表達的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠大腦皮層GFAP、AQP-4的蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05,P<0.01)。與模型組相比,6 h溶栓組大鼠大腦皮層GFAP、AQP-4的蛋白表達水平升高,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組、6 h溶栓組相比,針刺+6 h溶栓組大鼠大腦皮層GFAP、AQP-4的蛋白表達水平均降低(P<0.05,P<0.01)。見圖10。

注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較, #P<0.05;與6 h溶栓組比較,圖10 各組大鼠大腦皮層GFAP、AQP-4蛋白 表達結(jié)果比較

4 討論

2019年美國心臟學會/美國卒中學會指南推薦4.5 h內(nèi)進行rt-PA靜脈溶栓治療急性腦梗死[11]。溶栓療法的使用突破了以往的治療效果。在腦梗死發(fā)生的超早期進行rt-PA溶栓治療,如使用得當,可迅速消除患者肢體功能障礙等癥狀,顯著提高患者的神經(jīng)功能和日常生活能力。但是臨床使用rt-PA靜脈注射存在著非常嚴格的時間窗(3～4.5 h)[2]限制,大部分患者及家屬會延誤靜脈溶栓治療的最佳時間[12]。一旦超過時間窗界限,不僅達不到預期的溶栓療效,還會進一步破壞BBB,增加出血性轉(zhuǎn)化[13]、腦水腫[14]等溶栓并發(fā)癥的風險。本實驗發(fā)現(xiàn)大鼠發(fā)生腦梗死后,會出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷、腦組織破壞、BBB通透性增加以及腦組織水腫等癥狀;溶栓時間窗內(nèi)(4.5 h)進行單純?nèi)芩ㄖ委熁蜥槾膛浜先芩ㄖ委?均具有較理想的腦保護效應且作用相仿。而在腦梗死發(fā)病6 h進行溶栓,更易產(chǎn)生出血性轉(zhuǎn)化、腦水腫等溶栓副作用,降低了溶栓安全性;但是針刺及時介入后,在腦梗死發(fā)病6 h進行溶栓,能夠顯著改善神經(jīng)功能,減小腦梗死體積百分比,降低BBB通透性,減輕腦水腫等,仍具有安全性的效應。因此,針刺早期介入到腦梗死溶栓治療中,可提高溶栓安全性,延長溶栓時間窗。

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多、分布最廣的一類膠質(zhì)細胞,生理條件下,可發(fā)揮代謝支持、控制神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、調(diào)節(jié)BBB等作用,維持大腦正常功能[15-17]。作為BBB組成部分之一,星形膠質(zhì)細胞對維持BBB結(jié)構(gòu)功能具有重要作用。腦缺血再灌注后,星形膠質(zhì)細胞活化增殖,在梗死灶周圍及遠離的腦區(qū)形成大量的反應性星形膠質(zhì)細胞,早于巨噬細胞和反應性小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì),啟動炎癥級聯(lián)反應,從而破壞BBB,造成缺血再灌注期損傷[18-19]。因此,可通過抑制星形膠質(zhì)細胞活化來保護BBB。GFAP是星形膠質(zhì)細胞特異性標記蛋白,正常腦組織中僅有少量表達。當腦缺血再灌注發(fā)生后,受損區(qū)域腦組織的星形膠質(zhì)細胞被激活,此時GFAP表達量會增加,故其表達量的增加通常作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后星形膠質(zhì)細胞活化增生的標志[20]。AQP-4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的水通道蛋白,廣泛存在于星形膠質(zhì)細胞中[21],可介導星形膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)水在腦、血管和腦室之間的交換,并參與腦缺血后星形膠質(zhì)細胞激活,是決定星形膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)功能的重要分子。研究表明,下調(diào)AQP-4表達,可削弱腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞激活,減輕腦水腫損傷[22]。

本研究中qPCR和Western blot實驗結(jié)果提示:模型組GFAP、AQP-4表達均明顯高于假手術(shù)組,說明腦梗死發(fā)生后星形膠質(zhì)細胞大量活化,破壞腦組織;造模后6 h予以單純?nèi)芩ㄖ委?星形膠質(zhì)細胞仍在活化,說明超時間窗溶栓不能發(fā)揮腦保護的作用,會影響溶栓療法的應用;在造模后2 h予以針刺配合6 h內(nèi)溶栓治療能夠顯著降低GFAP、AQP-4表達,表明針刺可抑制星形膠質(zhì)細胞活化,保護BBB,減少超時間窗溶栓的并發(fā)癥,提高超時間窗溶栓安全性。

本研究證實了針刺早期介入能夠通過抑制星形膠質(zhì)細胞活化提高超時間窗溶栓安全性,更好地發(fā)揮腦保護作用,為臨床治療腦梗死提供新的思路。此外,星形膠質(zhì)細胞活化增生的標志AQP-4與GFAP之間的交互作用仍不明確,有待進一步研究。