靳雅惠

(西安外事學(xué)院，陜西 西安 710077)

桂郁金作為干燥塊根入藥，來源于姜科植物廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang，在活血止痛，行氣解郁等方面功效顯著，可治療胸脅刺痛、胸痹心痛等癥[1]。姜黃素類(姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素)作為郁金的主要化學(xué)成分[2]，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用[3～5]。近年來，姜黃素類在化學(xué)成分[6～7]、提取工藝[8]、藥理作用[9]等方面的研究越來越深入，但現(xiàn)有文獻(xiàn)中未曾有以種質(zhì)為研究對象，對桂郁金姜黃素類成分測定的報(bào)道，不利于桂郁金優(yōu)良種質(zhì)的篩選。遺傳因子即“種質(zhì)”，是藥用植物質(zhì)量優(yōu)劣的根本內(nèi)在機(jī)理，藥用植物優(yōu)良種質(zhì)篩選是提高藥材質(zhì)量的有效途徑，也是中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的內(nèi)在要求[10]，筆者立足于桂郁金種質(zhì)，測定了50份材料姜黃素類成分含量，為桂郁金優(yōu)良種質(zhì)篩選及良種繁育工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 植物材料

50份桂郁金種質(zhì)前期均來自于廣西玉林、邕寧、桂平等地，集中種植于邕寧藥材基地，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王建教授鑒定均為姜科姜黃屬植物桂郁金，即廣西莪術(shù)塊根Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang。60℃干燥后粉碎，過40目篩備用。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 Waters 2690高效液相色譜儀；電子天平；多功能粉碎機(jī)；超聲波清洗儀；Agilent SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)

1.2.2 試劑 姜黃素對照品(批號：R25M6S1)；去甲氧基姜黃素對照品(批號：Y14JS9060)，雙去甲氧基姜黃素對照品(批號：YM0506YA14)，三種對照品均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%。乙腈色譜純，冰醋酸、甲醇等為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇

通過二極管陣列檢測器對三種姜黃素類成分分別進(jìn)行掃描，姜黃素①、去甲氧基姜黃素②、雙去甲氧基姜黃素③的最大吸收波長分別為426 nm、420 nm、415 nm，出于對各組分的檢測信號強(qiáng)度和靈敏度的考慮，確定檢測波長為420 nm。為表述方便簡潔，后續(xù)使用代號①、②、③表示不同的姜黃素成分。

2.2 色譜條件

流動相：A相為乙腈，B相為0.25%的冰醋酸水溶液，梯度洗脫，見表1，檢測波長420 nm,柱溫30℃；流速1 mL·min-1,進(jìn)樣量10 μL。將混合對照品連續(xù)進(jìn)樣5次用以評價(jià)系統(tǒng)的適應(yīng)性，姜黃素類各成分拖尾因子均小于1.2，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均不少于3 000。HPLC色譜圖見圖1、圖2。

表1 程序梯度洗脫表

圖1 混合對照品溶液HPLC

圖2 桂郁金樣品HPLC

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液制備 精密稱定各種質(zhì)桂郁金粉末0.5 g，加入甲醇溶液30 mL，超聲提取器提取60 mim(40 KHz，300 W)，揮干溶劑，用甲醇溶解后定容于2 mL量瓶，上清液過0.45 μm微孔濾膜，取10 μL進(jìn)樣，作為供試品溶液。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱定三種對照品適量，加入甲醇制成每1 mL分別含有①0.0781 mg、②0.0385 mg、③0.0366 mg的溶液，即得儲備液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 不同質(zhì)量濃度的對照品溶液由上述儲備液稀釋制成，按上述色譜條件，依次對不同濃度對照品溶液進(jìn)行測定，進(jìn)樣量10 μL，橫坐標(biāo)代表對照品濃度，縱坐標(biāo)代表峰面積，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。三種姜黃素類的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍分別是①：y=112 733x-50 920，R2=0.9995，線性范圍為1.5792-16.4464 μg·mL-1；②：y=463 046x-190 699，R2=0.9999,線性范圍為0.5264-11.3963 μg·mL-1；③：y=322 307x-205 776，R2=0.9998，線性范圍為0.4353-6.3593 μg·mL-1。結(jié)果表明，三種姜黃素類成分的線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀。按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，①、②、③的RSD值分別為0.52%、0.50%、0.88%，由此可見，該方法精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一種質(zhì)桂郁金藥材粉末6份，精密稱定，制備供試品溶液并進(jìn)行含量測定，結(jié)果顯示，①、②、③的RSD分別為0.64%、0.55%、0.83%，由此可見，該方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一種質(zhì)樣品于不同時(shí)間段進(jìn)樣(0、2、4、6、8、12 h)測定峰面積，結(jié)果顯示，①、②、③的RSD分別為1.02%、0.75%、0.92%，由此可見，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取已知含量的桂郁金藥材粉末，約0.25 g，共6份，精密稱定加入等同于樣品中的①、②、③含量的80%、100%、120%的對照品，參照上述方法進(jìn)行供試品制備和HPLC分析，計(jì)算得出回收率。在回收率試驗(yàn)中，每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)，計(jì)算得到平均回收率，如表2所示。由表可知，①、②、③的平均回收率分別為100.37%、100.66%、101.05%，RSD分別為2.49%、2.31%、2.71%，由此可見，加樣回收率試驗(yàn)符合方法學(xué)要求。

表2 姜黃素類成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品測定

按上述方法制備桂郁金各種質(zhì)供試品溶液并進(jìn)行3種姜黃素類成分的測定，每個(gè)種質(zhì)平行3次，記錄色譜圖，用外標(biāo)法計(jì)算3種姜黃素類成分的含量，如表3所示，50個(gè)不同種質(zhì)桂郁金中，①、②、③的含量范圍分別為1.658 0～15.293 0μg·g-1、0.535 9～8.120 6μg·g-1、0.501 1～5.191 7μg·g-1，總姜黃素的含量范圍為1.963 5～26.839 8μg·g-1。50個(gè)桂郁金種質(zhì)中，有32個(gè)種質(zhì)檢測到3種類型姜黃素，占到了所有種質(zhì)的64%，表明3種類型姜黃素在大部分桂郁金種質(zhì)中存在，且含量差異顯著。7個(gè)種質(zhì)檢測到2種類型姜黃素，4個(gè)種質(zhì)檢測到1種類型姜黃素，7個(gè)種質(zhì)未檢測到任何類型姜黃素。

3 討論

3.1 提取條件的考察

為了得到供試品最佳提取條件，依次考察了提取溶劑、提取方式和提取時(shí)間三個(gè)要素。在提取溶劑考察中，采用100%甲醇提取效率較高且峰形較好，50%甲醇和無水乙醇提取效率和峰形均較差，這可能是由于姜黃素類化合物水溶性差卻極易溶解在甲醇中，故選擇100%甲醇提取。在提取方式考察中，甲醇冷浸測定結(jié)果不理想，超聲提取和加熱回流結(jié)果相差不大，為了節(jié)約時(shí)間，故選擇超聲提取法。在提取時(shí)間考察中，取30 min、60 min、90 min三個(gè)梯度，結(jié)果顯示60 min姜黃素類成分已基本提取完全，和90 min提取結(jié)果相差無異，故選擇60 min作為提取時(shí)間。

3.2 流動相的選擇

分別運(yùn)用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.25%冰醋酸等流動相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，甲醇-水無法將3種姜黃素分開，乙腈-水形成的峰形較差，乙腈-0.1%磷酸和乙腈-0.25%冰醋酸均可得到分離度較好的峰形，這是由于酸性物質(zhì)改善了拖尾現(xiàn)象，且0.25%冰醋酸效果更好，基線平穩(wěn)，分析時(shí)間短，故選擇乙腈-0.25%冰醋酸為流動相。

3.3 測定結(jié)果分析

筆者實(shí)驗(yàn)建立的HPLC方法能夠同時(shí)測定桂郁金中3種姜黃素類成分的含量，共測定了50個(gè)不同種質(zhì)，各種質(zhì)所含姜黃素類成分類別及含量差異顯著，表明不同種質(zhì)藥材質(zhì)量優(yōu)劣各異。筆者研究在7個(gè)種質(zhì)中未檢測到任何1種姜黃素類成分，可能是由于這7個(gè)種質(zhì)本身質(zhì)量不佳，含量較低，或者是采收加工中使用的方法不當(dāng)，導(dǎo)致部分姜黃素類成分損失。在11個(gè)種質(zhì)中檢測到1種或2種姜黃素類成分，可能是由于這些種質(zhì)本身其余成分含量較低，或者受姜黃素類成分見光易分解的影響，分解為同一類物質(zhì)。

表3 50份不同種質(zhì)桂郁金姜黃素類成分含量