張婉菁,王漢屏

(西安外事學(xué)院，陜西 西安 710077)

近幾年，國內(nèi)對(duì)蘋果酒制備方法研究頗多，眾多企業(yè)生產(chǎn)的蘋果酒也相繼上市，但由于國內(nèi)缺乏對(duì)酒用蘋果品種大面積栽培，生產(chǎn)企業(yè)通常只能選用鮮食型蘋果來釀造，導(dǎo)致果酒的香氣和口感較為平淡，從而嚴(yán)重影響了市場銷量并致使利潤停滯不前。

素有“長壽之王”的硒元素作為人體必需的微量元素在人體以硒酶、硒蛋白的形式存在，其營養(yǎng)價(jià)值極高，可清除自由基、排毒、預(yù)防衰老、增強(qiáng)免疫力，還可預(yù)防各類疾病，如克山病，癌癥，心腦血管疾病等。硒元素廣泛分布于身體肝臟、骨骼肌及脂肪中，美國科學(xué)家[1]調(diào)查顯示持續(xù)6個(gè)月每日攝入400 μg硒的老年人其免疫力明顯比對(duì)照組的老人有所提高，且體內(nèi)T細(xì)胞增加了27%，NK細(xì)胞增加至58%，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明能顯著增強(qiáng)中性粒細(xì)胞功能；英國研究者表明硒元素可使血清總膽固醇和極低密度膽固醇含量均明顯降低[2]。硒是谷胱甘肽過氧化物酶的活動(dòng)中心，有清除過氧化物的作用，達(dá)到抑制癌細(xì)胞生長的作用[2]。同時(shí)，硒還具有保護(hù)修復(fù)心臟維持其功能穩(wěn)定的重要因素，芬蘭研究者[3]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血清中硒含量水平在45 μg·L-1以下時(shí)，心肌梗死、冠心病和心血管疾病的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)都會(huì)大幅提高；硒在降低糖尿病發(fā)病率和生殖系統(tǒng)方面也起有益作用。因此，富硒食品營養(yǎng)保健功能毋庸置疑。而我國大部分地區(qū)都是缺硒地區(qū)，故中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦每人每日攝入硒50 μg[4]。若能改進(jìn)完善現(xiàn)有蘋果酒釀造工藝，釀制出高品質(zhì)、高營養(yǎng)的富硒蘋果酒，必將帶來可觀的市場前景。目前市場上眾多果酒類產(chǎn)品中尚未見到此種復(fù)合干型富硒蘋果酒，故大力研究開發(fā)此類產(chǎn)品將具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

為改善蘋果酒的香氣和口感，用3種不同品種的蘋果和4種其它水果進(jìn)行了雙重混合，并對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，制備了一種果香更濃郁、口感更為豐滿的復(fù)合干型富硒蘋果酒，其營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味都得到了明顯提升。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紅富士、金冠、澳洲青蘋、桃、葡萄、香蕉、菠蘿；安琪果酒專用酵母菌粉SY；氫氧化鈉，冰糖，果膠酶，檸檬酸，蜂蜜，鹽酸(分析純)，抗壞血酸，SO2。

1.2 儀器設(shè)備

AUY220 電子分析天平(Shimadzu Philippines公司)；BL-BJQ-20L全自動(dòng)機(jī)械攪拌不銹鋼液體發(fā)酵罐系統(tǒng)(貝朗生物工程設(shè)備江蘇有限公司)；HH-US醫(yī)用/三用恒溫水箱(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)；LRH-1500F生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司 )；PHS-3C 數(shù)顯酸度計(jì)(上海嘉鵬科技有限公司)；ZNHW 電熱套(上海道京儀器有限公司)。

1.3 工藝流程

蘋果一分選一洗凈一去核皮一熱燙一榨汁一過濾一護(hù)色—巴氏滅菌—低溫貯藏

葡萄、菠蘿、桃、香蕉一分選一清洗一去皮(除梗)一切分一榨汁一過濾一護(hù)色—巴氏滅菌—低溫貯藏

蘋果汁、復(fù)合果汁一混合一酶解—澄清一調(diào)配—接種一發(fā)酵一陳釀一過濾一灌裝一復(fù)合果酒

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 果汁制備 將分選出的已成熟的紅富士、金冠、澳洲青蘋3個(gè)品種的蘋果及桃、葡萄、香蕉、菠蘿分別清洗干凈，切碎分別榨取各自果汁，用抗壞血酸護(hù)色，巴氏滅菌后于低溫下分別貯藏備用。

1.4.2 混合調(diào)配 采用硒富集技術(shù)將各種果汁制成富硒果汁；以4.5～6∶1.5～2∶1～2的比例將富硒紅富士蘋果汁、富硒金冠蘋果汁、富硒澳洲青蘋果汁混合；按57∶10∶18∶10∶5的質(zhì)量比將富硒混合蘋果汁與先前已榨取好的桃汁、葡萄汁、香蕉汁、菠蘿汁混合，然后用0.5 g·L-1的果膠酶酶解，澄清后分離；用蜂蜜調(diào)整混合果汁的糖度，使其含糖量達(dá)到18%～25% ，再用檸檬酸調(diào)整其酸度，使其酸度達(dá)到6～8 g·L-1；

1.4.3 殺菌及酵母活化 向混合果汁中添加60～220 mg·L-1的SO2和450 mg·L-1的安琪果酒專用酵母菌粉SY，在16～28℃條件下靜置發(fā)酵，至發(fā)酵液的總糖含量達(dá)到3.5～4 g·L-1時(shí)終止發(fā)酵。

1.4.4 封裝 用果膠酶使其酒液澄清，30 min后50℃下靜置數(shù)小時(shí)直至澄清效果良好，必要時(shí)加入1%明膠，膜過濾機(jī)精濾，罐裝后經(jīng)巴氏滅菌即得成品。

1.5 蘋果酒的發(fā)酵因素單因素試驗(yàn)

1.5.1 三種蘋果汁混合比例對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響 在糖度為21%，pH值為3.6，酵母量為0.200%的相同條件下，分別取質(zhì)量比為6∶2∶1，5∶2∶1，4.5∶1.5∶2的富硒紅富士蘋果汁、富硒金冠蘋果汁、富硒澳洲青蘋果汁，在25℃下進(jìn)行發(fā)酵，陳釀后得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三種果酒并品評(píng)產(chǎn)品。

1.5.2 酵母添加量對(duì)發(fā)酵工藝的影響 在pH值為3.6，糖度為21%，發(fā)酵溫度為25℃的相同條件下，分別接種果汁量0.050%、0.100%、0.150%、0.200%、0.250%的酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，以酒精度和硒含量為指標(biāo)評(píng)價(jià)果酒發(fā)酵效果。

1.5.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵工藝的影響 在糖度為21%，pH值為3.6，酵母接種量為0.200%，分別選取16℃、19℃，22℃、25℃、28℃的發(fā)酵溫度，以酒精度和硒含量為指標(biāo)評(píng)價(jià)果酒發(fā)酵效果。

1.5.4 SO2用量對(duì)發(fā)酵工藝的影響 含糖量為21%，初始pH值為3.6，酵母接種量為0.200%，溫度22℃下分別在40、100、140、180、220 mg·L-1的SO2濃度下得到5種不同的果酒，以酒精度和硒含量為指標(biāo)評(píng)價(jià)品評(píng)發(fā)酵效果。

1.6 蘋果酒的發(fā)酵因素優(yōu)化試驗(yàn)

進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)確定各因素最優(yōu)區(qū)間范圍，選取質(zhì)量比為4.5∶1.5∶2蘋果汁和混合果汁為原料，以酵母菌添加量、發(fā)酵溫度、SO2濃度三因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)(見表1)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 三種蘋果汁混合比例對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響

由表l可知，得到的三種干型蘋果酒中Ⅲ型的富硒紅富士蘋果汁、富硒金冠蘋果汁、富硒澳洲青蘋果汁的質(zhì)量比為4.5∶1.5∶2時(shí)，所釀造的果酒酒精度最高，分別高出Ⅰ型、Ⅱ型的1.5%和0.2%，Ⅰ型中紅富士所占比例最高故口感偏甜但硒含量較Ⅱ、Ⅲ型低，可能與發(fā)酵過程中酵母菌破壞等因素有關(guān)，Ⅲ型感官評(píng)分最高視為質(zhì)量最佳(見表2)。因此，選取此質(zhì)量比的蘋果汁與剩余果汁混合發(fā)酵進(jìn)行單因素及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表2 不同比例的三種蘋果汁的混合發(fā)酵結(jié)果對(duì)比

2.2 酵母添加量對(duì)發(fā)酵工藝的影響

酵母添加量由0.05%增加至0.20%時(shí)，酒精度從10.4%vol迅速增長至11.9%vol，酵母添加量繼續(xù)增加至0.25%時(shí)，硒含量和酒精度均達(dá)最高，分別為75 ug·kg-1，12.01%vol，隨后便開始下降(見圖1)。原因是發(fā)酵時(shí)接入較多的酵母菌群后迅速繁殖，消耗了酒樣中的大量糖分，從而破壞了發(fā)酵環(huán)境致使其提前衰老并發(fā)生自溶[6]，后期酒精度下降并產(chǎn)生濃厚的酵母味影響酒品質(zhì)。故選擇果酒發(fā)酵酵母接種量0.2%，0.3%，0.4%進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同酵母添加量對(duì)復(fù)合蘋果酒酒精度及硒含量的影響

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵工藝的影響

從16℃開始酒精度隨溫度呈直線上升，斜率最大，當(dāng)發(fā)酵液溫度達(dá)22℃酒精度最高12%并保持平穩(wěn)，下降幅度較小且慢，硒含量則從19℃開始平穩(wěn)上升至22℃達(dá)0.074 ug·kg-1，隨后快速下降(見圖2)。試驗(yàn)表明，溫度在25～28℃時(shí)酵母自身生長和繁殖過快，同時(shí)消耗大量糖類物質(zhì)，產(chǎn)生的副代謝產(chǎn)物愈多，使酒精度偏低[7]，對(duì)香氣起負(fù)面影響。此外，溫度過高時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)生的蘋果酸澀味略重，外觀色澤均受到影響。因此，果酒發(fā)酵溫度選擇19℃，22℃，25℃進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)合蘋果酒酒精度及硒含量的影響

2.4 SO2用量對(duì)發(fā)酵工藝的影響

SO2用量從40 mg·L-1上升至100 mg·L-1，酒精度和硒含量呈直線上升，但SO2用量達(dá)到100 mg·L-1后酒精度與硒含量均滑坡式下降(見圖3)。SO2可抑制酒體的雜菌，使用過量也會(huì)抑制酵母菌的存活[8]，進(jìn)而影響果酒的發(fā)酵質(zhì)量和果酒的品質(zhì)。因此，選用SO2濃度分別為80 mg·L-1，100 mg·L-1，120 mg·L-1進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖3 SO2用量對(duì)復(fù)合蘋果酒酒精度及硒含量的影響

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的結(jié)果基礎(chǔ)之上，選取酵母添加量(0.2%、0.3%、0.4%)、溫度(19℃、22℃、25℃)、SO2用量(80 mg·L-1、100 mg·L-1、120 mg·L-1)為自變量，酒精度作響應(yīng)值，根據(jù) Box-Behnken 原理[9]設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果方差分析和模型失擬試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出：首先，模型的F=60.22，并且P 值<0.0001，證明該模型差異性顯著有一定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)P=0.2454(>0.05)，表現(xiàn)為不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最后校正確定相關(guān)系數(shù)R2=0.9769，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.9471，表明該模型擬合程度較好，總變異中有5.29% 不能用此方程解釋[9](見表5)。綜合上述，可用此模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析預(yù)測。

將表3所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Design-Expert8.0.6.1軟件進(jìn)行分析(見表4)。

表4 模型失擬試驗(yàn)

通過對(duì)表4分析：由各個(gè)因素P值可知，各因素對(duì)酒精度的影響大小順序?yàn)椋篠O2用量>酵母菌添加量>發(fā)酵溫度，SO2用量P< 0.0001(<0.05)對(duì)酒精發(fā)酵影響極顯著；其次，酵母菌添加量也對(duì)蘋果酒的酒精度有顯著的影響，發(fā)酵溫度則在適宜酵母菌生存的范圍內(nèi)對(duì)酒精度的影響不顯著[10]。同時(shí)C2小于 0.001(< 0.05)表現(xiàn)為極顯著、B2小于0.05表現(xiàn)顯著。

2.5.1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素的相互影響 發(fā)酵溫度和酵母菌添加量對(duì)酒精發(fā)酵的交互影響不顯著。隨著發(fā)酵溫度的上升和酵母菌添加量的增大，酒精度逐漸增加，溫度為 26℃、酵母菌添加量為0.08%～0.10% 時(shí)，酒精度最高為13.24%，而當(dāng)這2個(gè)因素的量再次提高后，酒精濃度逐漸下降。發(fā)酵溫度和發(fā)酵液pH對(duì)酒精發(fā)酵的交互影響不顯著。

2.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)的最佳優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證 通過使用 Design expert 8.0.6.1 軟件對(duì)試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化并結(jié)合試驗(yàn)條件，優(yōu)化得到干型蘋果酒酒最佳發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵溫度 21.97 ℃、酵母菌添加量 0.27%、SO2添加量120 mg·L-1。去零取整后的工藝條件：發(fā)酵溫度 22℃、酵母菌添加量0.3%、SO2添加量120 mg·L-1。在此最佳條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，與軟件優(yōu)化的結(jié)論吻合性較好，具有較高的可信性。

圖4 酵母添加量、發(fā)酵溫度、SO2用量交互作用對(duì)干型蘋果酒酒精度影響的響應(yīng)面和等高線

表5 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳釀酒工藝條件，以期為生產(chǎn)高品質(zhì)“富硒”復(fù)合干型蘋果酒提供理論依據(jù)。以復(fù)合富硒蘋果汁為原料，在單因素基礎(chǔ)上利用Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)影響酒精度的主要釀造因子進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在此優(yōu)化工藝條件下得到的酒精濃度為 12.3%，且糖度最低僅4 g·L-1，硒含量占0.075%，且該蘋果酒有機(jī)酸及單寧含量較高[11]。各因素發(fā)酵工藝的影響顯著性大小為：SO2用量>酵母菌添加量>發(fā)酵溫度。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際確定最適發(fā)酵條件為：酵母添加量0.3%，發(fā)酵溫度為25.0℃，SO2用量為100 mg·L-1；3種蘋果汁的最佳配比為4.5∶1.5∶2。