石碧茹，高建，趙晶，劉二偉，高秀梅，韓立峰（天津中醫(yī)藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津市中藥化學與分析重點實驗室，天津 301617）

墨旱蓮始載于唐代 《新修本草》，為菊科一年生草本植物醴腸Eclipta prostrateL.的干燥地上部分，是中醫(yī)常用補陰中藥。性寒，味甘、酸，入肝、腎經(jīng)，入陰血、善斂固，具有滋補肝腎、烏須固齒、涼血止血等功效[1]。墨旱蓮主要的化學成分有三萜類、內酯類、香豆草醚類、黃酮類、噻酚類、甾體類、揮發(fā)油以及有機酸等[2-5]。關于墨旱蓮的含量測定報道大多集中在香豆草醚和黃酮類上，如蟛蜞菊內酯、異去甲基蟛蜞菊內酯、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、醴腸醛、木犀草素、芹菜素齊墩果酸[6-10]。本課題組對墨旱蓮化學成分的研究發(fā)現(xiàn)其皂苷類成分含量較高，采用超高效液相色譜配合亞2 μm小顆粒粒徑填料色譜柱，對墨旱蓮藥材提取物進行了快速分離，再配合高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜平臺（HPLC-QQQMS），建立了指紋圖譜定性方法[11]，結果顯示墨旱蓮A為墨旱蓮藥材中含量較高的化學成分。

文獻報道，旱蓮苷A具有抑菌、抗肺纖維化、抑制骨關節(jié)炎等多方面藥理活性[12-14]，最近有文獻報道旱蓮苷A還能抑制非小細胞肺癌[15-16]。研究中藥提取純化的單體活性成分的藥動學行為對新藥開發(fā)具有重要意義。本課題組前期對旱蓮苷A口服藥動學及組織分布進行了系統(tǒng)研究[17]，由于皂苷類成分大多具有口服吸收不好，生物利用度低的特點，本研究進一步利用HPLC-QQQ-MS技術，測定大鼠尾靜脈注射給藥旱蓮苷A后藥動學參數(shù)，為旱蓮苷A的生物利用及后續(xù)新藥開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

SD 雄性大鼠6 只，體質量在（200±20）g [SPF級，天津市山川紅實驗動物科技有限公司]。所有大鼠在統(tǒng)一環(huán)境下適應性飼養(yǎng)1周，每日12 h明暗交替，溫度22℃，期間自由飲食和飲水。

1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6430三重四極桿質譜儀（Agilent公司）；Mill-QⅡ型超純水器（Millipore公司）；3K15高速離心機（Sigma公司）；N-EAVP 111氮吹儀（美國Organomation公司）；AX205十萬分之一天平（Mettler Toledo公司）；XW-80A渦旋混合器（滬西分析儀器廠）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；－80℃超低溫冰箱（美國Thermo Heto公司）。

1.3 試藥

乙腈、甲醇（色譜純，德國默克公司）；色譜純試劑乙酸（美國TEDIA試劑公司）；超純水由Mill-QⅡ 型超純水凈化系統(tǒng)制得；生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司）。旱蓮苷A對照品（實驗室自制得到，經(jīng)過HPLC-ELSD檢測，其純度＞98%[17]）；人參皂苷Rg1（內標，純度＞98%，成都曼思特生物科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件和質譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.05%乙酸水（B），梯度洗脫（0～1 min，10%～60%A；1～5 min，60%～90%A；5～9 min，90%A；9～10 min，90%～10%A，10～16 min，10%A）；流速0.4 mL·min－1，柱溫25℃；進樣量5 μL。

離子源為電噴霧離子源（ESI源），采用多反應監(jiān)測（MRM）模式，負離子監(jiān)測；毛細管電壓為4.0 kV，以N2作為干燥氣，干燥氣溫度為350℃，流速設定10 mL·min－1。旱蓮苷A和人參皂苷Rg1優(yōu)化后的離子對，碰撞能量，碎裂電壓見表1。

表1 優(yōu)化后質譜參數(shù)及用于定量分析的離子通道Tab 1 Optimized mass parameters and MRM transitions

2.2 對照品儲備液和內標溶液配制

精密稱取旱蓮苷A 10.00 mg和人參皂苷Rg11.00 mg，分別置于10 mL量瓶中，用體積分數(shù)為50%的甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別配制為1 mg·mL－1和100 μg·mL－1的對照品儲備液，然后將旱蓮苷A對照品儲備液稀釋得到一系列不同質量濃度的工作液（20.0、50.0、100.0、500.0、1000.0、2000.0 ng·mL－1）。人參皂苷Rg1用50%的甲醇稀釋得到質量濃度為250 ng·mL－1內標溶液。對照品溶液儲存在4℃冰箱備用。

2.3 血漿樣品處理

取冷凍的大鼠血漿樣品，于室溫融化后渦旋、混勻。精密吸取血漿樣品100 μL，置于1.5 mL離心管中，依次精密加入10 μL內標溶液（250 ng·mL－1人參皂苷Rg1）、10 μL空白甲醇溶液，渦旋1 min混勻，再加入380 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋振蕩10 min 后靜置，14 000 r·min－1離心10 min，取上清液進樣測定。

2.4 方法學考察[18-19]

2.4.1 專屬性試驗 取空白血漿100 μL，不加內標，其他按照“2.3”項下方法處理，進樣分析；將對照品溶液（500 ng·mL－1）及內標溶液（250 ng·mL－1）加入空白血漿中，同法處理；取大鼠尾靜脈給藥后的血漿樣品，同法處理；結果顯示目標化合物及內標峰形良好，血樣中無內源性物質干擾（見圖1）。

圖1 空白血漿（A）、空白血漿加對照品（B）、大鼠給藥后的血漿樣品（C）總離子流（TIC）圖Fig 1 TIC chromatogram of blank plasma（A），blank plasma spiked with ecliptasaponin A and the IS（B），and plasma sample after administration（C）

2.4.2 線性關系的考察 取空白血漿100 μL，加入內標溶液10 μL和系列濃度對照品溶液各10 μL，除不加10 μL空白甲醇溶液外，其他按照“2.3”項下方法操作，最終標準曲線各點質量溶液濃度為2.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 ng·mL－1，取上清液5 μL進樣測定。以血漿樣品中待測物與內標的峰面積比值（Y）為縱坐標，以待測物質量濃度（X）為橫坐標，用加權最小二乘法進行回歸計算，權重系數(shù)為1/χ，得回歸方程為Y＝0.2113X＋0.0060，r為0.9985。

2.4.3 精密度與準確度考察 取大鼠空白血漿100 μL，加入旱蓮苷A對照品配制成質量濃度為5.0、50.0、200.0 ng·mL－1的血漿樣品各6 份，按“2.3”項下方法操作，連續(xù)測定3 d，計算待測化合物峰面積和內標峰面積比值，代入隨行標準曲線中計算濃度。測定3批血漿樣品，分別計算日內、日間精密度和準確度，結果旱蓮苷A日內及日間精密度RSD值均小于5.6%，準確度在86.63%～106.59%，表明該方法的精密度與準確度良好。

2.4.4 提取回收率與基質效應 取空白血漿100 μL，分別加入質量濃度為200、2000、8000 ng·mL－1的墨旱蓮苷A對照品溶液各10 μL，按“2.3”項下方法操作，進樣測定；配制旱蓮苷A的質量濃度為5.0、50.0、200.0 ng·mL－1的血漿樣品各3 份，進樣測定；另取空白血漿，按“2.3”項下方法操作，得含空白基質的殘渣，分別加入100 μL 80%甲醇配制低、中、高的旱蓮苷A對照品溶液復溶，進樣測定，記錄兩次旱蓮苷A的峰面積，計算提取回收率；同樣條件下，進樣相應低、中、高濃度對照品溶液；將對照品溶液與純對照品得出的峰面積相比，計算得到基質效應。旱蓮苷A各濃度提取回收率在71.30%～81.30%（RSD＜7.3%），基質效應在70.29%～88.61%（RSD＜12.0%），均符合生物樣品檢測的要求。

2.4.5 血漿質控樣品穩(wěn)定性考察 取空白血漿100 μL，配制成旱蓮苷A質量濃度為5.0、50.0、200.0 ng·mL－1的對照品血漿樣品，將血漿樣品室溫放置24 h，反復凍融3 次和－80℃凍融7 d后處理并測定，將樣品實測值與初始值比較，結果準確度在91.37%～119.82%，RSD在4.5%～13.3%，表明樣品在儲存和處理過程中相對穩(wěn)定。

2.5 藥動學實驗

SD雄性大鼠6 只，體質量在（200±20）g，給藥前禁食12 h，自由飲水，尾靜脈注射旱蓮苷A生理鹽水混懸液（1 mg·kg－1），分別于給藥前及給藥后0、0.08、0.17、0.33、0.67、1、1.5、2、4、6、12、24 h經(jīng)大鼠眼底靜脈叢取血約0.3 mL，置于1.5 mL肝素化離心管中，6000 r·min－1離心10 min，分離血漿，置于－80℃冰箱中儲存，直至進樣分析。根據(jù)不同時間點血藥濃度具體結果，采用DAS 1.0軟件計算大鼠尾靜脈注射給藥后旱蓮苷A后的藥動學參數(shù)見表2；平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

表2 大鼠尾靜脈注射旱蓮苷A后主要藥動學參數(shù)(n＝6)Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of ecliptasaponin A in rat after intravenous injection (n＝6)

圖2 大鼠尾靜脈注射旱蓮苷A后的平均血藥濃度-時間曲線圖（n＝6）Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of ecliptasaponin A in rats after intravenous administration（n＝6）

由結果可知，大鼠尾靜脈給藥旱蓮苷A后符合二室開放藥動學模型，旱蓮苷A的血藥濃度在第一個取血時間點達峰，并在體內迅速分布，血藥濃度在1 h之內迅速下降，說明化合物在體內的消除速度很快，半衰期較短。

3 討論

生物樣品基質組成復雜，而一般目標化合物含量比較低，樣品在測定前需要選用恰當?shù)那疤幚矸椒?，使目標化合物純化和富集，一方面可以除去介質中蛋白質、脂肪和尿素等較大分子物質的干擾，另一方面也可以將與蛋白質或其他內源性物質結合的藥物解離下來進行測定。本實驗對蛋白沉淀法和液液萃取法進行了考察，結果蛋白沉淀法比液液萃取法更方便、簡單、快速，故采用蛋白沉淀法對旱蓮苷A在大鼠血漿進行前處理。蛋白沉淀法分別采用1∶3、1∶4的甲醇、乙腈，結果顯示，1∶4的甲醇沉淀蛋白回收率較好。

采用LC-MS進行血樣定量分析時，為了減少樣品處理中的操作誤差、藥物濃度低、內源性雜質干擾、質譜檢測時因離子化效率不同產(chǎn)生的差異等問題，在實驗中常加入內標來校正。實驗中選擇了與旱蓮苷A結構相似、色譜行為相近、檢測組分中沒有的且與所含成分不發(fā)生相互作用的人參皂苷Rg1作為內標。梯度洗脫方式，分離度較好，質譜響應穩(wěn)定，無內源性干擾[19]。

結合課題組前期報道過大鼠口服旱蓮苷A后的相關藥動學參數(shù)[17]及本實驗尾靜脈注射后得到的藥動學參數(shù)，根據(jù)公式，絕對生物利用度F＝（AUC PO/劑量PO）/（AUC IV/劑量IV），可計算出旱蓮苷A的生物利用度約為1.68%。表明旱蓮苷A的生物利用度較低，后續(xù)新藥開發(fā)時應予以重點關注。