高愛莉 代歆悅 李華平 王煥麗 馬少吟 陳教全 朱慧蘭

(廣州市皮膚病防治所，廣州 510095)

外陰陰道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是一種常見的皮膚黏膜疾病，據(jù)統(tǒng)計，有10%～15%的婦女患無癥狀型VVC，75%的育齡期婦女至少經(jīng)歷1次VVC，40%～50%的婦女患病2次及以上[1]。復(fù)發(fā)性外陰陰道念珠菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)指 12個月中確實發(fā)作4次或4次以上有癥狀的VVC，約8%的成年婦女患有RVVC[2]。VVC的臨床癥狀呈非特異性，主要表現(xiàn)為外陰瘙癢，外陰和陰道紅斑、水腫和皸裂，部分患者伴有陰道酸痛和刺激，嚴(yán)重者有明顯的排尿困難。重度 VVC 是指臨床癥狀嚴(yán)重，外陰或陰道皮膚黏膜有破損，按 VVC 評分標(biāo)準(zhǔn)[3]，評分≥7分者(見表1)。VVC的發(fā)作與復(fù)發(fā)給人們身心帶來不良影響。

文獻(xiàn)顯示VVC患者中大量細(xì)胞因子表達(dá)異常[4-5]，多項研究也證實了白細(xì)胞介-17(interleukin-17，IL-17)和白細(xì)胞介-23(IL-23)等細(xì)胞因子在陰道念珠菌中具有重要的免疫保護(hù)作用[6-8]。而高遷移率族蛋白 1(high mobility group box-1，HMGB1)是高遷移率族蛋白中的一員，既往研究認(rèn)為HMGB1是一種重要的內(nèi)源性信號分子，在DNA結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要的作用。近年來發(fā)現(xiàn)，HMGB1是一種晚期炎癥介質(zhì)，可由免細(xì)胞和壞死受損細(xì)胞釋放至細(xì)胞外，隨后遷移至炎癥部位結(jié)合相應(yīng)受體，如TLR4、RAGE等，誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生、趨化，促進(jìn)晚期炎癥[9]。VVC是一種真菌感染引起的炎癥性疾病，而HMGB1與VVC發(fā)病關(guān)系暫未見有相關(guān)報道。

表1 VVC臨床癥狀評分Tab.1 The clinical symptom scores of VVC

本研究旨在于探討IL-17、IL-23 及 HMGB1 在 VVC 患者血清及陰道分泌物中的表達(dá)情況，以及三者表達(dá)與 VVC臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，試圖闡明其在VVC發(fā)病機(jī)制中的作用，為尋找新的治療靶點提供一定理論依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 資料

選擇2016年12月至2018年12月廣州市皮膚病防治所門診就診的年齡為18～50歲性活躍期婦女。常規(guī)詢問病史及婦科檢查, 對臨床懷疑外陰陰道念珠菌病的患者, 取其陰道分泌物做真菌鏡檢和培養(yǎng)鑒定。以真菌鏡檢有假菌絲且培養(yǎng)鑒定為白念珠菌的患者作為入選病例，隨機(jī)選取105例VVC患者，并按照臨床癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)分為輕中度VVC組、重度VVC組及RVVC組，選擇正常體檢者，陰道分泌物檢查白細(xì)胞陰性，真菌鏡檢陰性, 培養(yǎng)陰性的39例作為正常對照組。所有患者由主診醫(yī)師詳細(xì)記錄主要臨床資料，包括：姓名、年齡、病程、臨床癥狀評分、1個月內(nèi)是否使用過激素治療、1個月內(nèi)是否使用過抗生素治療、1個月內(nèi)是否服用過避孕藥、是否使用宮內(nèi)節(jié)育器、是否妊娠、糖尿病及血糖控制情況、1個月內(nèi)是否使用免疫抑制藥物等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有自身免疫性或免疫缺陷疾病者; ②妊娠或合并其他生殖器感染性疾病者; ③有特殊藥物服用史者; ④1周內(nèi)陰道給藥和陰道灌洗者。

1.2 方法

標(biāo)本采集及處理 ①外周血標(biāo)本采集：采集所有受試者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血5 mL，離心分離血清，-80℃保存?zhèn)溆?。②陰道分泌物采集：所有受試者取材時均常規(guī)消毒外陰, 將統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的專用干棉簽置于陰道后穹窿處留置30 s，取出后，一份棉拭子進(jìn)行真菌涂片及培養(yǎng)，另一份棉拭子放入有1 mL無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)的Eppendor管中，充分轉(zhuǎn)動后取出棉拭子，再將Eppendor管3 000 r/min離心3 min，吸取上清液，儲存于-80℃冰箱備用檢測。

檢測方法 采用 ELISA 檢測血清及分泌物中HMGB1(南京建成公司)、IL-17(杭州聯(lián)科公司)及IL-23(杭州聯(lián)科公司)及含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明進(jìn)行，并根據(jù)試劑盒提供的樣本制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 求出標(biāo)本的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

本研究共納入VVC患者105例，平均年齡為 (33.4±9.8)歲，其中輕中度VVC組51例、重度VVC組21例、RVVC組33例；對照組39例，平均年齡(31.2±8.8)歲。

2.2 血清及分泌物中HMGB1與IL-17、IL-23檢測結(jié)果

外周血中，重度VVC組及RVVC組患者HMGB1水平均較正常組高(P<0.05)，輕中度及重度VVC組IL-17水平均高于對照組(P<0.05)。輕中度及重度VVC組、RVVC組IL-23水平均高于對照組(P<0.05)；分泌物中，輕中度及重度VVC組、RVVC組IL-17水平均高于對照組(P<0.05)。輕中度及重度VVC組、RVVC組IL-23水平均高于對照組(P<0.05)見表2～4及圖1～3。

表2 各組患者外周血中HMGB1的水平Tab.2 The levels of HMGB1 in peripheral blood

表3 各組患者外周血及陰道分泌物中IL-17的水平Tab.3 The levels of IL-17 in peripheral blood and vaginal discharge

表4 各組患者外周血及陰道分泌物中IL-23的水平Tab.4 The levels of IL-23 in peripheral blood and vaginal discharge

圖1 各組患者外周血中HMGB1的水平 圖2 各組患者外周血及分泌物中IL-17的水平 圖3 各組患者外周血及分泌物中IL-23的水平Fig.1 The levels of HMGB1 in peripheral blood Fig.2 The levels of IL-17 in peripheral blood and vaginal secretions Fig.3 The levels of IL-23 in peripheral blood and vaginal discharge

2.3 HMGB1水平與IL-17表達(dá)的相關(guān)性分析

研究發(fā)現(xiàn)，外周血中HMGB1水平與IL-17、IL-23表達(dá)成正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5及圖4。

表5 外周血中HMGB1水平與IL-17、IL-23表達(dá)相關(guān)性分析Tab.5 Correlation analysis of the HMGB1 level and IL-17, IL-23 expression in peripheral blood

2.4 IL-23與IL-17表達(dá)的相關(guān)性分析

對105例VVC患者外周血及分泌物中IL-23水平與IL-17進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：外周血及分泌物中IL-23的表達(dá)水平與IL-17的表達(dá)均成正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表6及圖5。

表6 外周血及分泌物中IL-23水平與IL-17相關(guān)性分析Tab.6 Correlation analysis of IL-23 and IL-17 in peripheral blood and vaginal discharge

2.5 HMGB1、IL-17、IL-23與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

研究發(fā)現(xiàn)，患者外周血中HMGB1水平與疾病嚴(yán)重度成正相關(guān)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；分泌物中IL-17水平與疾病嚴(yán)重度成正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表7。

表7 IL-17、IL-23及HMGB1水平與VVC疾病嚴(yán)重度相關(guān)性分析Tab.7 Correlation analysis of IL-17, IL-23 and HMGB1 with the severity of VVC

圖4 HMGB1水平與IL-17、IL-23表達(dá)的相關(guān)性 圖5 IL-23與IL-17表達(dá)的相關(guān)性Fig.4 Correlation analysis of the HMGB1 level with IL-17, IL-23 expression Fig.5 Correlation analysis of IL-17, IL-23 expression

3 討 論

念珠菌屬于條件致病性雙相菌，有酵母相及菌絲相，酵母相通常為無癥狀寄生狀態(tài)，當(dāng)各種誘因?qū)е聶C(jī)體免疫力降低時，念珠菌大量繁殖，并由酵母相則可轉(zhuǎn)化為形成菌絲相，侵襲組織能力增強(qiáng)，導(dǎo)致陰道炎的產(chǎn)生，目前國內(nèi)外研究普遍認(rèn)為細(xì)胞免疫在念珠菌感染中起主要的抗感染保護(hù)作用[10-11]。IL-17是一個常見的促炎因子，它是Th17細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子，其分泌受到Th17細(xì)胞的分化水平影響，而高表達(dá)的IL-23可誘導(dǎo)Th17的分化增多。Kagami等[12]也發(fā)現(xiàn)，腸道念珠菌定植患者體內(nèi)可檢測到高表達(dá)的IL-17。動物實驗發(fā)現(xiàn)局部IL-23可能在小鼠陰道念珠菌病的發(fā)病機(jī)制中起一定作用，在感染過程中具有保護(hù)作用[6]。并且在人類陰道念珠菌病中也證實了IL-17、IL-23等細(xì)胞因子發(fā)揮著重要的免疫保護(hù)作用[6-8]。

HMGB1作為一種晚期炎癥介質(zhì)，近年來也發(fā)現(xiàn)其在一些感染性及炎癥性疾病中發(fā)揮作用， Jhun等[13]發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎患者外周血中HMGB 1水平明顯升高，提示HMGB1可能參與感染性疾病和局部炎癥反應(yīng)。另有研究表明，甘草素是HMGB1最常見的抑制劑，其可通過TLR4途徑降低IL-23、IL-17等炎性因子表達(dá)，減輕心肌缺血/再灌注損傷[14]。而HMGB1是否也參與了VVC的疾病發(fā)生，暫未見報道。

據(jù)此，我們檢測了VVC患者及健康者體內(nèi)HMGB1、IL-17、IL-23的水平，并分析各指標(biāo)及其與VVC臨床癥狀指標(biāo)間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)外周血中，重度VVC組及RVVC組患者外周血中HMGB1水平均高于對照組(P<0.05)，輕中度及重度VVC組IL-17水平均高于對照組(P<0.05)，輕中度及重度VVC組、RVVC組IL-23水平均高于對照組(P<0.05)，且HMGB1水平與IL-17、IL-23表達(dá)成正相關(guān)(P<0.05)，IL-23水平與IL-17表達(dá)成正相關(guān)(P<0.05)；而分泌物中，輕中度及重度VVC組、RVVC組IL-17水平均高于對照組(P<0.05)，僅輕中度VVC組IL-23水平高于對照組(P<0.05)，IL-23水平與IL-17表達(dá)亦成正相關(guān)(P<0.05)。由此我們推測：VVC患者體內(nèi)存在高水平的HGMB1，其可通過結(jié)合TLR4受體，促進(jìn)IL-23誘導(dǎo)的IL-17表達(dá)，或直接上調(diào)IL-17的表達(dá)，可能參與VVC的發(fā)病。在該研究中，部分研究組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，如重度VVC組中IL-23與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與我們收集的病例數(shù)較少，后續(xù)將進(jìn)一步進(jìn)行大樣本的檢測，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

隨后，我們分析了天然免疫相關(guān)因子與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)：外周血中，HMGB1水平與疾病嚴(yán)重度成正相關(guān)(P<0.05)；分泌物中，IL-17水平與疾病嚴(yán)重度成正相關(guān)(P<0.05)。這一結(jié)果提示，HMGB1、IL-17的水平一定程度上提示了VVC患者的病情嚴(yán)重程度。說明二者與外陰陰道念珠菌病的發(fā)病、病情嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，血清及分泌物中 HMGB1、IL-17、IL23 在 VVC 患者中顯著高表達(dá)，且三者與疾病活動性密切相關(guān)，推測三者有望成為VVC治療和預(yù)防的新靶點，值得進(jìn)一步深入研究探討。