趙興濤，車先閣，王書濤，劉詩瑜，苑媛媛

(燕山大學 電氣工程學院 河北省測試計量技術及儀器重點實驗室，河北 秦皇島 066004)

1 引 言

我國每年蜂蜜的出口可占全球蜂蜜總出口量的20%[1]，蜂蜜質量問題越來越受到廣泛關注。2019年8月的國家市場監(jiān)管部門在發(fā)布食品不合格情況通告中，曾有多批次蜂產品檢出喹諾酮類抗生素，因此,建立一種快速有效的蜂蜜中抗生素檢測體系是尤為重要的。喹諾酮類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強、價格低廉等特點，被廣泛應用于獸醫(yī)學中[2]。在蜂蜜實際生產過程中,喹諾酮類藥物可以防治蜂病如美洲幼蟲腐臭病、麻痹病等，并且能夠提高蜂蜜產能[3]。但是，喹諾酮類藥物在動物體內代謝緩慢，容易產生蓄積和殘留,人體長期服用抗生素殘留過量的蜂蜜會造成潛在的危害，特別是機體對抗生素的耐藥性[4]。

目前，針對蜂蜜中喹諾酮類抗生素的檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質譜法等。夏環(huán)等[5]采用分子印跡固相萃取-高效液相色譜法對蜂蜜中3種喹諾酮類抗生素殘留進行了檢測，3種抗生素的加標回收率范圍為96.5%～104.1%；徐宜宏等[6]采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜法對蜂蜜中多種抗生素進行了殘留檢測，實驗結果得到的平均回收率范圍為68.0%～104.0%，相對標準偏差為3.2%～15.5%。但是這些方法對操作人員的要求較高，樣本預處理比較復雜，提取過程也不易操作[7]。而三維熒光光譜法具有靈敏度高、操作簡單、不需要大量樣本的特點，近年來被廣泛應用到食品有害物質殘留檢測及環(huán)境污染檢測中[8]。尹春玲等[9]采用三維熒光光譜結合交替不對稱三線性分解法(AATLD)對牛奶中弗洛沙星、培氟沙星和伊諾沙星進行了檢測研究，實驗結果令人滿意，定量解析出的弗洛沙星、培氟沙星和伊諾沙星的平均回收率分別為97.87±4.91%，97.55±5.45%，102.13±5.75%；Osorio等[10]采用熒光光譜結合多元校正的方法對養(yǎng)殖水體中的氟喹諾酮類藥物進行了殘留測定，實驗基于二階和三階校準共建立了兩種校正模型，經過實驗結果對比后證明，三階校正模型U-PLS-RTL擁有更好地擬合度和性能指標，得到的樣品回收率范圍在93%～112%之間。但是目前采用三維熒光光譜法對蜂蜜中喹諾酮類抗生素的檢測研究的類似報導很少。

本文采用三維熒光光譜法對蜂蜜可能存在的3種喹諾酮類抗生素殘留，氟甲喹(FLU)、恩諾沙星(ENR)和左氧氟沙星(LVFX)的混合組分溶液進行熒光測量，將二級瑞利散射區(qū)置零和空白溶劑扣除法消除了光譜中的二級瑞利散射和拉曼散射干擾，采用小波優(yōu)化集合經驗模態(tài)分解(ensemble empirical mode decomposition, EEMD)的方法對光譜進行去噪，完成光譜預處理過程。結合雙線性最小二乘/殘差雙線性(BLLS/RBL)方法，對預處理前后的光譜數據進行定性、定量檢測，該檢測手段有效地解決了混合組分中出現(xiàn)的光譜重疊問題，實現(xiàn)了利用“數學分離”代替“化學分離”。預處理前后的定量結果對比表明：樣本經過預處理后，其定性、定量結果更為準確。

2 實 驗

2.1 主要試劑與儀器

實驗試劑：荊花蜂蜜，京東汪氏蜂蜜官方旗艦店購買；喹諾酮類抗生素標準品，F(xiàn)LU標準品(純度98%)、ENR標準品(純度98%)，LVFX標準品(純度98%)均購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉SDS(化學純)購買于國藥試劑網；超純水，由優(yōu)普純水儀(成都優(yōu)普儀器設備有限公司)制備。

實驗儀器：FA1004精密電子秤(鄭州寶晶電子科技有限公司)；FS920穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(英國愛丁堡公司)；HY-5A回旋振蕩器(國華電器有限公司)。

2.2 實驗樣本制備

實驗溶劑制備：精確稱量10 g SDS標準品，適量超純水溶解至燒杯中，水浴加熱10 min，待冷卻至室溫后，用超純水定容至100 mL棕色容量瓶中，得到濃度為100 g·L-1的SDS儲備液，4 ℃避光保存。移液槍量取5.5 mL SDS儲備液，用超純水定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為5.5 g·L-1的SDS實驗溶液。

蜂蜜溶液制備：精確稱量2.733 39 g蜂蜜溶于100 mL,、濃度為5.5 g·L-1的SDS溶劑中，得到蜂蜜濃度為27.333 9 g·L-1的蜂蜜實驗溶液。

抗生素單組分對照樣本制備：精確稱量FLU、ENR、LVFX標準品各0.01 g，用SDS實驗溶液定容至100 mL容量瓶中，回旋振蕩20 min后，得到濃度為0.1 g·L-1的3種物質的儲備液，于4 ℃避光保存。移液槍量取0.4 mL FLU儲備液、0.04 mL的ENR和0.02 mL的LVFX儲備液，用SDS工作溶液定容至100 mL容量瓶中，得到40 μg·L-1的FLU實驗溶液、4 μg·L-1的ENR實驗溶液和2 μg·L-1的LVFX實驗溶液。

蜂蜜抗生素殘留溶液制備：分別取適量抗生素的標準溶液依次添加進蜂蜜溶液中，共配制了16組不同濃度的抗生素殘留溶液樣本，各樣本蜂蜜的濃度均為27.333 9 g·L-1，其中C1-C10設定為校正集，T1-T6設定為預測集，如表1所示。

表1 校正樣本及預測樣本濃度Tab.1 Concentration of calibration and prediction samples μg/L

3 實驗結果與分析

3.1 光譜預處理

3.1.1 去散射處理研究

將FS920光譜儀進行參數設置： 激發(fā)波長范圍設置為250～450 nm，步長為 5 nm; 發(fā) 射 波 長 范 圍設置為290～550 nm，步長為2 nm; 并設置發(fā)射波長滯后激發(fā)波長10 nm，以消除一級瑞利散射干擾[11]。入射狹縫和出射狹縫設置為2 mm，樣品室溫度設置為恒定20 ℃。

設置完畢后，對實驗配制樣本進行三維熒光光譜掃描，得到16組131×41的數據矩陣。其中測得純蜂蜜樣本C3的三維熒光投影圖和等高線圖如圖1所示。

從圖1中可以看出，光譜圖存在二級瑞利散射(1)和拉曼散射(2)的干擾。二級瑞利散射的特點是散射波長約為激發(fā)波長的2倍，而拉曼散射的散射波長比激發(fā)波長略大，隨著激發(fā)波長的變化而相應變化，且與激發(fā)波長保持恒定的頻率差。這兩種散射均無法通過儀器參數設置來消除，且散射的熒光強度遠遠大于被測物質的熒光強度，使得被測物質的光譜被掩蓋，無法對物質進行精確分析。

圖1 蜂蜜原始光譜圖Fig.1 Original spectrum of honey

為此，采用將二級瑞利散射區(qū)置零和空白溶劑扣除的方法來消除光譜中的二級瑞利散射和拉曼散射，蜂蜜去散射后的熒光光譜圖如圖2所示。

從圖2中可以看出，去除光譜中的二級瑞利散射后，蜂蜜的光譜得以部分顯現(xiàn)出來，但是由于拉曼散射的存在，不能反映出光譜的全部信息。當去除拉曼散射后，蜂蜜的光譜得以完整地顯現(xiàn)出來，可以看出蜂蜜存在兩個熒光峰，分別位于最佳激發(fā)/發(fā)射波長為285/326 nm和345/436 nm處。但是光譜圖存在很明顯的噪聲干擾，不利于后續(xù)的定性、定量研究。

圖2 蜂蜜去散射后的熒光光譜圖Fig.2 The fluorescence spectrum of honey after de scattering

3.1.2 小波優(yōu)化EEMD算法原理與評價指標

EEMD工作原理的實質是，通過EEMD分解被測光譜數據， 得到若干個本征模態(tài)分量(intrinsic mode function, IMF)，按頻率從高到低排列，通過將噪聲集中的IMF分量舍去，剩余分量疊加重構，完成對光譜的去噪過程[12]。

但是該方法同樣存在缺陷，即保留的IMF分量中，也有少量噪聲存在，相應地，舍棄的IMF分量也有非噪聲信號存在，舍棄過多分量會造成過度去噪，相反，則會造成去噪不完全。

為此提出采用小波閾值法對選取的IMF分量進行二次去噪，再進行重構的思想完成光譜去噪過程。具體過程如下:

(1) EEMD分解：運用EEMD方法分解給定的含噪光譜數據，得到若干個IMF分量。

(2) 選取IMF分量：求取原始光譜與其IMF分量的相關系數，相關系數較大的IMF保留不作處理，相關系數小的IMF分量，利用小波閾值法進行二次去噪處理。

(3) 重構光譜：將保留的IMF分量與經過小波處理后的IMF分量疊加，得到去噪后的光譜。

3.1.3 去噪結果評價指標

引入信噪比(SNR)、波形相似系數(NCC)、均方根誤差(RMSE)來衡量不同去噪算法的結果[13]。SNR是指信號與噪聲的比例，信噪比越高，代表去噪效果越良好。NCC是計算降噪前后信號的波形的差異，其值越接近于1，說明過度去噪的程度越小。RMSE表示降噪前后數據差值的平方均值。計算公式分別為

(1)

(2)

(3)

3.1.4 去噪結果分析

采用小波優(yōu)化EEMD算法對光譜進行去噪處理，去噪后的蜂蜜等高線圖如圖3所示。將去噪結果分別與小波和EEMD的方法進行比較，不同方法去噪結果的評價指標如表2所示。

圖3 小波優(yōu)化EEMD去噪后的蜂蜜等高線圖Fig.3 Contour map of honey after denoising by wavelet optimization EEMD

從圖3和表2可以看出，小波優(yōu)化EEMD算法對光譜的去噪效果良好，在保持原有光譜特征的基礎上更加平滑、清晰，有利于后續(xù)的定性、定量研究。而且該方法的去噪結果評價指標均優(yōu)于小波和EEMD算法。將其余樣本數據均進行去散射、去噪處理。

表2 不同方法去噪結果評價指標Tab.2 Evaluation indexes of different noise removal methods

圖4分別給出經光譜預處理后的3種抗生素對照樣本和T5樣本的等高線圖，可以看出，LVFX有兩個熒光峰，分別位于最佳激發(fā)/發(fā)射波長為300/484 nm和330/484 nm處；ENR有兩個熒光峰，分別位于最佳激發(fā)/發(fā)射波長為280/440 nm和330/440 nm處；FLU有一個熒光峰，分別位于最佳激發(fā)/發(fā)射波長為325/364 nm處。3種抗生素物質熒光峰位置相似，其混合組分存在著嚴重的光譜重疊現(xiàn)象，而且抗生素混合組分的熒光強度強于蜂蜜，掩蓋了蜂蜜的熒光光譜，只憑觀測光譜圖難以定性區(qū)分溶液各物質組分。

圖4 C1、C2、C3和T1樣本預處理后的等高線圖Fig.4 Contour map after pretreatment of C1, C2, C3 and T1 samples

3.2 蜂蜜抗生素殘留混合溶液的定性定量分析

3.2.1 BLLS/RBL算法

BLLS/RBL是二階校正算法之一，可以實現(xiàn)復雜混合物分析的二階優(yōu)勢[14]。

該算法分為校正和預測兩個步驟，將被測物質的光譜數據分為校正集和預測集兩個部分，具體實現(xiàn)步驟如下[15]：首先將校正數據矩陣X(大小為J×K)矢量化，將Ic個校正樣本集分組為JK×Ic的矩陣，記作Vx：

Vx=[vec(X1)|vec(X2)|…|vec(XIc)]

(4)

式中vec為展開操作。

采用直接最小二乘，獲取單位濃度Vs下的單組分物質矩陣信息，該過程用公式表示為

Vs=VXY+

(5)

式中：Y+表示大小為I×Nc的校正濃度矩陣，Nc為校正分析物的數量。

Vs大小為JK×Nc，包含了矢量化的Sn矩陣：

Vs=[vec(S1)|vec(S2)|…|vec(SNc)]

(6)

如果每種分析物只含有一種光譜組分，Sn的秩將為1。因此可以通過每個大小為J×K的Sn矩陣的單組分奇異值分解(SVD1)來獲取組分輪廓圖,

(bn,gn,cn)=SVD1(Sn)

(7)

式中：bn是第一個奇異值；gn(J×1)和cn(K×1)分別為第一個左和右特征向量。

gn和cn分別是第n個分析物在J和K方向上的歸一化純輪廓。每個vec(Sn)根據bn，gn，cn重建，完成校準步驟。

Srn=bn[gn?cn]

(8)

式中?表示克羅內克乘積。

校準后，如果未知樣品不包含干擾物質，則可直接采用最小二乘法來估計測試樣品中的濃度。

(9)

式中：Xu為測試樣品數據；yu包含校準分析物Nc的估計濃度；Scal可以表示為

Scal=[b1(g1?c1)…bNc(gNc?cNc)]

(10)

3.2.2 定量結果評價指標

回收率(RH)表示樣本濃度真實值與預測值的接近程度，計算公式分別為

(11)

靈敏度(SL)表示單位濃度的凈分析信號,計算公式為

(12)

式中：hn是比例系數;||||F是矩陣的Frobenius范數。

檢出下限(Lout)表示在一定置信度下，可檢測的最低分析物濃度，計算公式為

Lout=3.3Sd(0)

(13)

式中：Sd(0)為低濃度樣本預測濃度的標準偏差。

3.2.3 定性鑒別

采用核一致值診斷法(core consistency diagonosis, CORCONDIA)[16]分別對光譜預處理前后的樣本進行組分數估計，一般認為當核一致值不低于60%時，結果最接近實際樣本組分數。經計算，未經預處理的樣本，當因子數設定小于6時，核一致值高于60%，但是樣本實際組分數為4，其原因是樣本存在的散射和噪聲被認定為了一個組分。而經預處理后的樣本，因子數設定為小于5時，核一致值高于60%，與實際組分數相同。由此可知采用預處理后的樣本的組分數估計更準確，而未經預處理的樣本不能正確估計組分數。

因此，采用BLLS/RBL算法分別對預處理前后的實驗樣本進行定性鑒別，并將各單組份抗生素實驗樣本數據同樣輸入進算法模型中，生成各組分抗生素的真實光譜曲線，與混合組分解析出的光譜形成對比，其定性結果分別如圖5和圖6所示。可以看出：數據經預處理后，解析的溶液中3種抗生素組分的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜與各自的真實光譜匹配程度十分良好，蜂蜜組分由于在混合溶液中的熒光強度較低，其解析光譜與真實光譜會有略微差異，但是綜合解析得到的蜂蜜的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，可以確定溶液中含有蜂蜜組分。

圖5 未經預處理樣本的解析光譜與原光譜Fig.5 Analytical and original spectra of untreated samples

圖6 經預處理后樣本的解析光譜與原光譜Fig.6 Analytical and original spectra of samples after pretreatment

為了更直觀地顯示出定性結果的準確性，表3給出了解析光譜與原光譜的相似度，可以看出經預處理后各組分解析光譜與原光譜的波形相似度較高。而未經預處理的定性結果，解析出的光譜包含散射和噪聲干擾，與原光譜的吻合程度明顯不如經預處理后的結果，且無法準確解析出蜂蜜組分。實驗結果表明：經預處理后的樣本采用三維熒光光譜結合BLLS/RBL算法可以完成蜂蜜中喹諾酮類混合物質的定性鑒別。

表3 BLLS/RBL解析光譜與原光譜的相似度Tab.3 similarity between BLLS/RBL analytical spectrum and original spectrum

3.2.4 定量檢測

采用BLLS/RBL分別對預處理前后的樣本進行定量檢測，其結果如表4所示?？梢钥闯鯞LLS/RBL方法定量經過預處理后的樣本得到的FLU的RH在86.92%～101.38%之間，平均回收率RA達到94.99±0.63%，Lout為2.08 μg/L；ENR的RH在93.25%～104.20%之間，RA達到100.20%，Lout為0.18 μg/L；LVFX的RH在95.38%～118.00%之間，RA達到103.20%，Lout為0.19 μg/L，均優(yōu)于未經預處理樣本的定量結果。此外，經預處理后的樣本的定量結果的均方根誤差(RMSE)與靈敏度SL同樣優(yōu)于未經預處理的樣本。由此表明：采用BLLS/RBL算法可以實現(xiàn)蜂蜜中喹諾酮類抗生素混合組分的定量分析，而且樣本經過預處理后，其定量結果的精度得到了顯著提高。

表4 濃度預測結果Tab.4 Concentration prediction results

4 結 論

針對蜂蜜中喹諾酮類抗生素的殘留問題，提出了采用三維熒光光譜技術結合BLLS/RBL算法實現(xiàn)蜂蜜中抗生素混合組分殘留的定性、定量檢測，該方法具有操作簡單，靈敏度高，無需復雜的樣品前處理過程等特點。研究了光譜數據預處理對定性、定量結果的影響，樣本經過預處理后，定性分析中樣本組分數的確定更加精準，定量分析中，各項評價指標相比未經預處理的檢測結果都有了提高。結果表明：對樣本進行預處理可以有效提升定性、定量結果的精度。