牛敬敬 劉雄波 陳鵬發(fā) 于斌 嚴(yán)偉 屈軍樂 林丹櫻

(深圳大學(xué)生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究中心/物理與光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)重點實驗室,深圳 518060)

熒光壽命顯微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM)技術(shù)在細(xì)胞微環(huán)境傳感中具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可定量的優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究.其中,基于時間相關(guān)單光子計數(shù)(time-correlated single photon counting,TCSPC)進(jìn)行熒光壽命探測的方法是目前最常用的技術(shù)之一,但受成像原理和條件限制,該技術(shù)存在數(shù)據(jù)采集時間較長、成像速度不夠快的不足.本文開發(fā)一種能對生物樣品中任意數(shù)量離散的、形狀不規(guī)則的感興趣區(qū)域(region of interest,ROI)進(jìn)行快速FLIM 成像的技術(shù).該技術(shù)利用聲光偏轉(zhuǎn)器(acousto-optic deflector,AOD)實現(xiàn)快速靈活的尋址掃描,并通過對ROI 形狀特征的簡單在線分析,實現(xiàn)AOD 與TCSPC 同步策略的優(yōu)化及壽命圖像的準(zhǔn)確重構(gòu),對于生物樣品中常見的存在多個離散不規(guī)則ROI情形,可大幅節(jié)省數(shù)據(jù)采集時間,從而實現(xiàn)對這些ROI 的快速FLIM 成像.采用該技術(shù),對氯化銨刺激下活細(xì)胞中溶酶體探針LysoSensor Green DND-189 的熒光壽命變化進(jìn)行了動態(tài)FLIM 成像,以監(jiān)測溶酶體管腔內(nèi)pH 值的實時變化情況.結(jié)果表明,該快速FLIM 技術(shù)可用于動態(tài)監(jiān)測生物樣品中微環(huán)境的變化,將在活細(xì)胞微環(huán)境傳感中發(fā)揮重要作用.

1 引言

熒光壽命顯微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM)技術(shù)在測量細(xì)胞微環(huán)境的離子濃度、黏度、折射率、溫度和pH 值等生化參數(shù)時具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可定量的優(yōu)點[1?3],因而在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著較為廣泛的應(yīng)用,成為生物醫(yī)學(xué)研究的重要工具.在各種FLIM 技術(shù)中,采用時間相關(guān)單光子計數(shù)(time-correlated single photon counting,TCSPC)的方法實現(xiàn)熒光壽命探測是目前最常用的做法,其原理是采用高重復(fù)頻率的脈沖激光激發(fā)樣品,同時由高靈敏度的探測器如光電倍增管(photomultiplier tube,PMT)探測單光子熒光信號,通過獲取每個激發(fā)周期內(nèi)熒光光子到達(dá)探測器的時間并進(jìn)行計數(shù),得到近似熒光強(qiáng)度衰減曲線的光子數(shù)-時間分布直方圖,從而擬合或計算得到熒光壽命值[4?8].一般而言,為了得到準(zhǔn)確的熒光壽命值,該方法要求激發(fā)光不能太強(qiáng)以避免一個周期產(chǎn)生多個熒光光子的“光子堆積”效應(yīng),但同時又要求每個像素點累積足夠多的光子數(shù)用于壽命擬合[9?11],因此實際應(yīng)用中通常將TCSPC-FLIM 與激光掃描共聚焦顯微術(shù)[12](laser scanning confocal microscopy,LSCM)或雙光子激發(fā)熒光顯微術(shù)[13](Two-photon excited fluorescence microscopy,TPEFM)結(jié)合,通過重復(fù)多次的逐點掃描來累積光子數(shù),實現(xiàn)FLIM 成像.

傳統(tǒng)的掃描成像系統(tǒng)通常采用振鏡對成像視場進(jìn)行柵掃描,掃描方式不夠靈活,且掃描時存在機(jī)械慣性,成像速度受到限制.聲光偏轉(zhuǎn)器(acousto-optic deflector,AOD)利用聲光晶體的聲光效應(yīng),可通過加載不同的聲波頻率改變其出射光的衍射角,從而實現(xiàn)光束的線性偏轉(zhuǎn),代替振鏡作為掃描器件.相比振鏡掃描,AOD 掃描不存在機(jī)械慣性問題,掃描速度快,重復(fù)精度高,并且由于兩個維度的偏轉(zhuǎn)可獨立控制,掃描方式很靈活,可實現(xiàn)跳躍性的快速尋址掃描[14,15].2013 年,深圳大學(xué)屈軍樂課題組[16]首次將AOD 尋址掃描應(yīng)用于TCSPC-FLIM,實現(xiàn)了對任意形狀感興趣區(qū)域(region of interest,ROI)的FLIM 成像.在該工作中,AOD掃描與TCSPC 數(shù)據(jù)采集之間只有一個同步信號,控制方式簡單,成像靈活.但這種方法由于需要逐點存儲壽命數(shù)據(jù)再進(jìn)行下一個像素點的采集,因此即使是對較小視場進(jìn)行成像通常也需要很長的采集時間(如10×10 像素需要3 min),成像速度較慢,并不適用于快速生物醫(yī)學(xué)過程的研究.2014 年,該課題組改用像素、行、幀三個信號對AOD 掃描和TCSPC 采集進(jìn)行同步控制,從而大幅節(jié)省了采集和存儲時間,提升了成像速度,實現(xiàn)了壞死因子(TNF-α)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡過程的FLIM 成像,以監(jiān)測其黏度和pH 值的變化過程,FLIM 成像速度達(dá)到了10 s/幀[17].然而,實際應(yīng)用中這種同步控制方式僅適用于單個矩形區(qū)域的掃描成像,否則后期數(shù)據(jù)重構(gòu)將過于復(fù)雜耗時,從而使AOD 快速尋址掃描的優(yōu)勢不能很好發(fā)揮出來,失去了對任意形狀ROI 尋址掃描的靈活性,對存在多個ROI 的情形更加無能為力.針對生物醫(yī)學(xué)研究中常見的存在多個離散不規(guī)則ROI 的情形,本文在上述工作的基礎(chǔ)上,通過對ROI 的形狀特征進(jìn)行簡單的在線分析,對AOD 掃描與TCSPC采集之間的同步控制方式進(jìn)行優(yōu)化,并發(fā)展相應(yīng)的壽命圖像數(shù)據(jù)處理方法,可方便地實現(xiàn)對視場中任意數(shù)量的離散、不規(guī)則ROI 的快速FLIM 成像,為FLIM 技術(shù)在活細(xì)胞微環(huán)境傳感等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一種新的手段.

2 系統(tǒng)與方法

2.1 快速FLIM 系統(tǒng)的搭建

圖1 為搭建的快速FLIM 系統(tǒng)示意圖.以商用倒置熒光顯微鏡(Ti2-U,Nikon)為框架,采用鈦寶石可調(diào)諧飛秒脈沖激光器(Chameleon Ultra II,Coherent)作為雙光子激發(fā)光源,常用波長為800 nm,峰值功率為3.8 W,重復(fù)頻率為80 MHz.激光經(jīng)半波片HWP 和偏振分束棱鏡PBS 調(diào)節(jié)功率、擴(kuò)束鏡BE1 擴(kuò)束準(zhǔn)直和光束提升鏡BL 提升后進(jìn)入二維AOD 掃描器2D-AOD.但由于AOD 中的聲光晶體為大色散介質(zhì),需在AOD 前引入一個色散棱鏡DP 對其引起的空間和時間色散進(jìn)行預(yù)校正[18].2D-AOD 由一對正交放置的AOD (DTSXY-400-640,AA Opto-electronic)組成,激光經(jīng)AOD 產(chǎn)生的衍射光偏轉(zhuǎn)角由加載在聲光晶體上的聲波頻率決定,因此采用衍射光作為掃描光時,通過加載不同的聲波頻率,就可以實現(xiàn)X-Y二維平面內(nèi)任意點的跳躍性掃描.聲波頻率信號由數(shù)據(jù)采集卡(USB-6353,National Instruments)輸出的數(shù)字信號轉(zhuǎn)換而成.掃描光經(jīng)擴(kuò)束鏡BE2 擴(kuò)束準(zhǔn)直后進(jìn)入顯微鏡,經(jīng)物鏡O (100×/1.45 NA,Nikon)聚焦激發(fā)樣品.產(chǎn)生的熒光經(jīng)二向色鏡DM、濾光片F(xiàn)T 和反射/透射比7:3 的分束鏡BS 同時被 PMT(PMC-100-0,Becker &Hickl GmbH)和EMCCD(DU897,Andor)收集.EMCCD 采集的熒光信號用于選取ROI;PMT 采集的熒光信號經(jīng)放大后傳輸給TCSPC 采集卡(SPC-150,Becker &Hickl GmbH)處理得到壽命數(shù)據(jù),并在計算機(jī)上由采集和分析軟件(SPCM,Becker &Hickl GmbH)存儲并實時顯示為熒光強(qiáng)度圖像,隨后可在該軟件(或其他壽命分析軟件)中分析得到各像素點的熒光壽命并顯示為熒光壽命圖像.

圖1 快速FLIM 系統(tǒng)示意圖Fig.1.Schematic diagram of fast FLIM system.

2.2 同步信號的產(chǎn)生策略

AOD 掃描與TCSPC 壽命數(shù)據(jù)的采集和存儲之間的同步控制,是上述快速FLIM 系統(tǒng)得以正常工作并獲得正確的熒光壽命圖像的關(guān)鍵.采用同一數(shù)據(jù)采集卡輸出的3 個脈沖信號作為像素(pixel)、行(line)、幀(frame)同步信號,分別控制壽命數(shù)據(jù)存儲時的像素與像素、行與行、幀與幀之間的切換[19],其中像素信號需要與控制AOD 掃描的數(shù)字信號保持嚴(yán)格同步,行信號由掃描區(qū)域中每行的像素個數(shù)決定,幀信號則由掃描區(qū)域的總像素數(shù)決定.通常情況下,三路同步信號均為周期信號,周期長度可根據(jù)掃描區(qū)域的行列數(shù)提前設(shè)定好.以掃描一個5×2 像素的矩形ROI 為例,控制AOD 掃描的數(shù)字信號和三路同步信號如圖2(a)所示,AOD掃描區(qū)域如圖2(b)所示,而TCSPC 數(shù)據(jù)采集和存儲如圖2(c)所示,其中數(shù)字代表數(shù)據(jù)存儲順序,不同顏色代表不同壽命值.

圖2 AOD 掃描信號及其與TCSPC 的同步原理示意圖 (a)數(shù)字信號及三路同步信號;(b) AOD 掃描過程;(c) AOD-TCSPC同步過程Fig.2.Schematic diagram of AOD scanning signal and its synchronization principle with TCSPC:(a) Digital signal and three synchronization signals;(b) AOD scanning process;(c) AOD-TCSPC synchronization process.

但顯然這種同步信號的產(chǎn)生策略只適用于單個矩形ROI,對于形狀不規(guī)則的或者多個離散的ROI 則不適用.為了實現(xiàn)對任意數(shù)量離散不規(guī)則ROI 的快速FLIM 成像,需要對同步信號的產(chǎn)生策略進(jìn)行優(yōu)化,使其能夠與所選ROI 的形狀特點相對應(yīng),以得到正確的熒光壽命圖像.以圖3(a)所示的3 個離散不規(guī)則ROI 為例,為了產(chǎn)生與其盡量匹配的同步信號,同時便于后期數(shù)據(jù)處理,需要對ROI 的形狀特征進(jìn)行在線分析.首先,找出包含所有ROI 的外接矩形區(qū)域(即圖中所示的6×6 像素區(qū)域),保存該外接矩形區(qū)域像素點的坐標(biāo)信息,用于后期數(shù)據(jù)處理;然后,計算每一行需要掃描的像素數(shù)(如第一行為3 個像素),用于調(diào)整行信號的輸出,即產(chǎn)生的同步信號應(yīng)如圖3(b) 和圖3(c)所示,其中行信號不再是周期信號,相鄰行信號脈沖的間距由當(dāng)前行需要掃描的像素數(shù)決定.根據(jù)這種策略產(chǎn)生的三路同步信號與所選ROI 的形狀是相對應(yīng)的,因此對于任意數(shù)量任意形狀的ROI 都是適用的,也包括前面提到的單個矩形ROI.值得指出的是,對于沒有像素點需要掃描的“空行”,實際上并不會有行信號產(chǎn)生,同時由于TCSPC 數(shù)據(jù)存儲是順序無結(jié)構(gòu)的,因此存儲下來的熒光壽命數(shù)據(jù)并不完全與ROI 中各像素點的實際掃描位置相對應(yīng),如圖3(d)所示,即存儲下來的壽命數(shù)據(jù)仍存在未關(guān)聯(lián)到準(zhǔn)確空間位置的問題,需要進(jìn)一步映射處理以得到準(zhǔn)確的壽命圖像.

圖3 針對任意數(shù)量離散不規(guī)則ROI 的同步信號產(chǎn)生新策略示意圖 (a)三個離散的不同形狀ROI(灰色);(b)每個掃描點所需的同步信號;(c)按新策略產(chǎn)生的三路同步信號;(d)已分行存儲但仍未準(zhǔn)確映射的熒光壽命數(shù)據(jù)Fig.3.Schematic diagram of a new strategy for generating synchronization signals for any number of discrete irregular ROIs:(a) Three discrete ROIs of different shapes (gray);(b) the synchronization signals required for each scan point;(c) three synchronization signals generated according to the new strategy;(d) fluorescence lifetime image data that has been stored in rows before mapping.

2.3 壽命圖像的重建

結(jié)合前面ROI 形狀分析得到的外接矩形區(qū)域信息,可以方便地對已分行存儲的壽命數(shù)據(jù)進(jìn)行映射處理,即將每個像素點得到的壽命數(shù)據(jù)移位到其實際的掃描位置處,以重構(gòu)出準(zhǔn)確的熒光壽命圖像.具體過程如圖4 所示.

首先,如圖4(a)—(c)所示,將掃描ROI 的坐標(biāo)信息與其外接矩形區(qū)域的坐標(biāo)信息進(jìn)行比較(取交集),可得到一個二值化矩陣(圖中數(shù)字表示非零元素,對應(yīng)ROI 內(nèi)的掃描像素).然后,如圖4(d)—圖4(f)所示,將該二值化矩陣中非零元素的列坐標(biāo)(圖4(d)中數(shù)字所示)與TCSPC 順序存儲時的列坐標(biāo)(圖4(e)中數(shù)字所示,參考圖3(d))進(jìn)行比較(相減),可計算得到每個像素的橫向相對位移(圖4(f)中數(shù)字所示),稱圖4(f)的矩陣為X方向的移位矩陣.同理,通過比較行坐標(biāo)(圖4(g)和圖4(h))可得到Y(jié)方向的移位矩陣,如圖4(i)所示.利用這兩個移位矩陣,就可以對壽命數(shù)據(jù)矩陣(圖4(j))進(jìn)行移位操作,從而得到準(zhǔn)確的壽命圖像,其中X方向移位操作結(jié)果如圖4(k)所示,繼續(xù)進(jìn)行Y方向的移位操作后,可得到如圖4(l)所示的壽命圖像.

圖4 壽命數(shù)據(jù)處理方法示意圖 (a)掃描ROI;(b)外接矩形;(c)二值化矩陣;(d)二值化矩陣非零元素列坐標(biāo);(e)壽命數(shù)據(jù)順序存儲列坐標(biāo);(f) X 方向移位矩陣;(g)二值化矩陣非零元素行坐標(biāo);(h)壽命數(shù)據(jù)順序存儲行坐標(biāo);(i) Y 方向移位矩陣;(j)未移位的壽命圖像;(k) X 方向移位后的壽命圖像;(l) Y 方向移位后的準(zhǔn)確壽命圖像Fig.4.Schematic diagram of the processing method for the lifetime image data:(a) Scanned ROIs;(b) circumscribed rectangle;(c) binarized matrix;(d) column coordinates of non-zero elements in the binarized matrix;(e) column coordinates of the lifetime data before mapping;(f) shift matrix in X-direction;(g) row coordinates of non-zero elements in the binarized matrix;(h) row coordinates of the lifetime data before mapping;(i) shift matrix in Y-direction;(j) lifetime image before mapping;(k) lifetime image after shift in X-direction;(l) correct lifetime image after shift in Y-direction.

這樣,通過在線分析所選ROI 的形狀特征并獲取其外接矩形區(qū)域的像素信息,不僅優(yōu)化了同步信號的產(chǎn)生策略,使得TCSPC 采集和存儲的壽命數(shù)據(jù)分行存儲,還可以通過簡單的運算對壽命數(shù)據(jù)進(jìn)行映射處理得到準(zhǔn)確的壽命圖像,從而實現(xiàn)對任意數(shù)量任意形狀ROI 的快速FLIM 成像.

3 結(jié)果與討論

3.1 任意數(shù)量離散不規(guī)則ROI 成像驗證

為了驗證上述方法對任意數(shù)量離散不規(guī)則ROI 的成像能力,以鈴蘭根莖切片(從Leica 公司采購的標(biāo)準(zhǔn)樣片)為例進(jìn)行成像,結(jié)果如圖5 所示.其中圖5(a)為EMCCD 采集的樣品明場圖像,通過LabVIEW 編寫的控制程序可在其上根據(jù)需要選取ROI(也可以在EMCCD 采集的寬場熒光圖像上選取),選取時可采用預(yù)設(shè)的形狀,也可以直接用鼠標(biāo)圈選任意不規(guī)則形狀,如圖中綠色圖形所示.完成選區(qū)后,數(shù)據(jù)采集卡產(chǎn)生對應(yīng)ROI 坐標(biāo)信息的數(shù)字信號,控制AOD 對激光進(jìn)行偏轉(zhuǎn),實現(xiàn)對選定ROI 的掃描和激發(fā);同時,程序自動完成如前文所述的ROI 形狀特征在線分析,并控制數(shù)據(jù)采集卡按照新策略產(chǎn)生對應(yīng)的三路同步信號,控制TCSPC 開始采集和存儲相應(yīng)的壽命數(shù)據(jù).圖5(b)為掃描過程中EMCCD 拍攝的熒光強(qiáng)度圖像,可以看到只有所選ROI 以內(nèi)的樣品被激發(fā)出熒光,其余部分沒有信號.圖5(c)為利用TCSPC 采集的數(shù)據(jù)直接分析得到的熒光壽命圖像,可以看出壽命數(shù)據(jù)已分行存儲,但由于未將壽命信息關(guān)聯(lián)到準(zhǔn)確的位置,圖像不能反映樣品的真實結(jié)構(gòu).圖5(d)為移位處理后的熒光壽命圖像,可以看到圖像中四個ROI 的結(jié)構(gòu)均與圖5(b)所示的熒光強(qiáng)度圖像符合得很好.

圖5 鈴蘭根莖切片樣品多個離散的不同形狀ROI 的FLIM成像 (a)明場圖像及ROI 的選取;(b) EMCCD 采集的熒光強(qiáng)度圖像;(c) TCSPC 采集得到的壽命圖像;(d)準(zhǔn)確重構(gòu)的熒光壽命圖像Fig.5.FLIM imaging of multiple discrete ROIs of different shapes in convallaria slice sample:(a) Bright field image collected by EMCCD and selection of ROIs;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD;(c) lifetime image collected by TCSPC;(d) corrected fluorescence lifetime image.

3.2 成像速度對比分析

本文所提的方法能夠?qū)崿F(xiàn)對ROI 的快速FLIM成像,本質(zhì)上是因為采用了尋址掃描方式,對于多個離散的、形狀不規(guī)則的ROI 而言,可以大幅減少非感興趣像素點的數(shù)量,從而間接提高成像速度.以鈴蘭根莖切片樣品為例,假設(shè)有生物學(xué)意義的ROI 為圖6(a)所示的環(huán)形區(qū)域,采用本文方法進(jìn)行FLIM 成像得到的結(jié)果如圖6 所示,其中圖6(b)為EMCCD采集的熒光強(qiáng)度圖像,圖6(c)為TCSPC 采集的光子計數(shù)累積得到的熒光強(qiáng)度圖像,圖6(d)為利用TCSPC 采集的光子計數(shù)進(jìn)行分析和重構(gòu)后得到的熒光壽命圖像.作為對比,圖7 所示為掃描包含該環(huán)形ROI 的矩形區(qū)域時得到的結(jié)果.可見,當(dāng)感興趣的結(jié)構(gòu)只是圖中環(huán)形ROI 部分時,采用本文的尋址掃描成像方式可以只采集環(huán)形ROI 中的數(shù)據(jù),而傳統(tǒng)柵掃描方式則至少需要對包含該ROI 的整個矩形區(qū)域進(jìn)行掃描,因而將許多原本不需要的像素包括在內(nèi),既增加了數(shù)據(jù)采集時間,也增加了數(shù)據(jù)處理負(fù)擔(dān).定量地,可統(tǒng)計得到圖6中環(huán)形ROI 包含的像素數(shù)為6164,而圖7 中矩形ROI 包含的像素數(shù)為15625,在保證單像素采集的最大光子數(shù)基本一致(分別為841 和824)的前提下,圖6 和圖7 的采集時間分別為3.0 s 和7.8 s,即由于環(huán)形ROI 像素數(shù)僅為矩形的約39%,相應(yīng)的采集時間縮短為矩形的38%,采集時間隨著掃描像素數(shù)的減少而成比例地減少.

圖6 鈴蘭根莖切片樣品環(huán)形ROI 的FLIM 成像 (a)環(huán)形ROI 的選取;(b) EMCCD 采集的熒光強(qiáng)度圖像;(c) TCSPC采集的熒光強(qiáng)度圖像;(d)熒光壽命圖像Fig.6.FLIM imaging of a circular ROI in convallaria slice sample:(a) Selection of the circular ROI;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD;(c) fluorescence intensity image collected by TCSPC;(d) fluorescence lifetime image.

圖7 鈴蘭根莖切片樣品矩形ROI 的FLIM 成像 (a)矩形ROI 的選取;(b) EMCCD 采集的熒光強(qiáng)度圖像;(c) TCSPC采集的熒光強(qiáng)度圖像;(d)熒光壽命圖像Fig.7.FLIM imaging of a rectangular ROI in convallaria slice sample:(a) Selection of the rectangular ROI;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD;(c) fluorescence intensity image collected by TCSPC;(d) fluorescence lifetime image.

在生物醫(yī)學(xué)成像實驗中,ROI 呈離散不規(guī)則分布的情況是非常多見的,例如對于細(xì)胞核或者細(xì)胞中其他細(xì)胞器的研究等.因此,對于這些情形,采用本文的方法可以大幅縮短數(shù)據(jù)采集時間,提高FLIM 成像速度.ROI 越小、越分散,采用這種方法的優(yōu)勢就越明顯.特別地,當(dāng)感興趣區(qū)域是一些離散點時,采用本文的方法不僅方便,而且可以達(dá)到非?？斓某上袼俣?為了驗證這一點,采用平鋪在蓋玻片上的羅丹明6 G 溶液為樣品,選取視場內(nèi)構(gòu)成“FAST FLIM”圖樣的87 個離散點進(jìn)行成像,結(jié)果如圖8 所示.由于掃描的像素數(shù)量非常少,熒光壽命圖像采集時間僅為52.2 ms,成像速度非常快.而傳統(tǒng)成像方式很難做到這一點,這是因為雖然TCSPC 采集時也有單點探測模式,但其探測的點是不能根據(jù)需求任意指定的,只能是視場中央的一個點,一般用于調(diào)試采集參數(shù).而采用本文的成像方式,即AOD 尋址掃描結(jié)合TCSPC 三路同步信號產(chǎn)生的新策略和圖像數(shù)據(jù)處理方法,就可以方便地做到任意離散點的快速FLIM 成像.

圖8 羅丹明6G 溶液樣品中離散點的快速FLIM 成像 (a)離散像素點的選取;(b) EMCCD 采集的熒光強(qiáng)度圖像;(c) TCSPC采集的熒光強(qiáng)度圖像;(d)熒光壽命圖像Fig.8.Fast FLIM imaging of discrete pixels in rhodamine 6G solution:(a) Selection of the discrete pixels;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD; (c) fluorescence intensity image collected by TCSPC;(d) fluorescence lifetime image.

3.3 活細(xì)胞成像應(yīng)用

利用本文的快速FLIM 成像方法,對氯化銨刺激下活細(xì)胞中溶酶體探針的熒光壽命變化進(jìn)行動態(tài)成像,以監(jiān)測溶酶體管腔內(nèi)pH 值的變化情況.實驗采用對pH 敏感的探針LysoSensor Green DND-189 標(biāo)記人肉骨瘤細(xì)胞(U2OS,37 ℃、5% CO2孵育)中的溶酶體(標(biāo)記濃度1 μM (1 M=1 mol/L),孵育時間30 min).首先如圖9(a)—(b)所示,選取一個感興趣細(xì)胞并拍攝其明場圖像和寬場熒光強(qiáng)度圖像,發(fā)現(xiàn)溶酶體的熒光信號比較集中,進(jìn)而選擇“1”和“2”兩個ROI進(jìn)行快速FLIM 成像,單幅采集時間為200 ms.成像過程中加入10 μL 濃度為1 μM 的氯化銨溶液對活細(xì)胞進(jìn)行刺激,并記錄加入氯化銨溶液后5 min 內(nèi)ROI 中的熒光壽命圖像,結(jié)果如圖9(c)和圖9(d)所示,其中圖9(c)表示加入氯化銨溶液刺激后兩個ROI 中溶酶體探針平均熒光壽命的變化,圖9(d)為部分時間點的熒光壽命圖像,時間點“0”對應(yīng)尚未加入氯化銨溶液時的結(jié)果.可以看到,在氯化銨的刺激下,兩個ROI 中溶酶體探針的熒光壽命都是先急劇變短,然后再緩慢變長.根據(jù)文獻(xiàn)[20]報道的探針LysoSensor-DND189 的熒光壽命與pH 值的關(guān)系(即pH 值越高,探針的熒光壽命越短;反之亦然),該過程中溶酶體探針的熒光壽命變化代表的是其管腔內(nèi)pH 值的變化情況,即在弱酸性溶液氯化銨的刺激下,活細(xì)胞中溶酶體管腔內(nèi)的pH 先急劇增大,然后再緩慢回落.該動態(tài)結(jié)果很好地記錄了對于外界的突然刺激溶酶體管腔內(nèi)pH 值的實時變化過程.而這種實時監(jiān)測結(jié)果,利用傳統(tǒng)的TCSPC-FLIM 是無法獲得的.

圖 9 活細(xì)胞 中LysoSensor-DND189 標(biāo)記溶 酶體的快速FLIM 成像 (a)明場圖像;(b) EMCCD 采集的熒光強(qiáng)度圖像及ROI 的選取;(c) ROI 平均熒光壽命隨氯化銨刺激時間的變化;(d)部分時間點的熒光壽命圖像Fig.9.Fast FLIM imaging of LysoSensor-DND189 labeled lysosomes in living cells:(a) Bright field image;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD and selection of ROIs;(c) the change of the average fluorescence lifetime in the ROIs with the stimulation time of ammonium chloride;(d) the fluorescence lifetime image of selected time points.

4 總結(jié)與展望

針對傳統(tǒng)TCSPC-FLIM 受成像原理和條件限制,存在數(shù)據(jù)采集時間長、成像速度不夠快的問題,本文開發(fā)了一種利用AOD 進(jìn)行尋址掃描,并通過對ROI 形狀特征的在線分析和AOD-TCSPC同步策略的優(yōu)化重構(gòu)出準(zhǔn)確壽命圖像的方法,從而實現(xiàn)了對任意數(shù)量的離散不規(guī)則ROI 的快速FLIM成像.本文詳細(xì)闡述了該快速FLIM 成像方法的原理和實現(xiàn)過程,并對該成像方法進(jìn)行了實驗驗證和性能分析.結(jié)果表明,利用該方法對任意數(shù)量的離散不規(guī)則ROI 進(jìn)行FLIM 成像均能夠得到正確反映樣品真實結(jié)構(gòu)的熒光強(qiáng)度圖像和壽命圖像,并且由于避免了對非感興趣像素點的掃描,可大幅節(jié)省采集時間,實現(xiàn)快速FLIM 成像.采用該技術(shù),對氯化銨刺激下活細(xì)胞中溶酶體探針LysoSensor-DND189 的熒光壽命變化進(jìn)行了動態(tài)FLIM 成像,實現(xiàn)了溶酶體管腔內(nèi)pH 值變化情況的動態(tài)監(jiān)測.該方法將為動態(tài)監(jiān)測生物樣品中某些感興趣對象(如細(xì)胞器等)的快速微環(huán)境變化提供很好的工具.