王雪姣 劉 蕊 胥 婷 施 羽 李林霞 衛(wèi)東琴 丁曉穎 彭永德

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡女性常見的生殖內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，其在育齡期女性中的患病率為6%～20%[1-2]。PCOS是一種具有終生傾向、全身代謝紊亂的內(nèi)分泌疾病，因其異質(zhì)性強(qiáng)，至今尚無完全有效的控制方法[3]。

腸道菌群作為一個(gè)龐大的微生物群，定植于人體腸道內(nèi)[4]，參與宿主的消化、營養(yǎng)、代謝、免疫等生理和病理過程，其失衡可能導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[5]。目前已有多項(xiàng)研究[6-8]顯示，PCOS患者存在腸道菌群紊亂，并且腸道菌群參與調(diào)控PCOS的發(fā)病。腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能改變影響腸-腦軸相關(guān)激素的分泌[9-10]。本團(tuán)隊(duì)的前期研究[6,11]發(fā)現(xiàn)，與非肥胖健康女性相比，PCOS患者存在腸道菌群紊亂，促生長激素釋放素(ghrelin)和肽YY(peptide YY，PYY)等腸-腦軸相關(guān)激素分泌減少，且與腸道菌群紊亂密切相關(guān)。以上研究提示，腸道菌群可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體腸-腦軸導(dǎo)致PCOS患者內(nèi)分泌代謝功能障礙。神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y, NPY)可以調(diào)節(jié)機(jī)體食欲、能量?jī)?chǔ)存等各種生理功能[12]。一項(xiàng)人群研究[13]結(jié)果顯示，能量限制聯(lián)合益生菌治療可使肥胖女性機(jī)體NPY水平升高。目前,鮮有研究關(guān)注NPY與PCOS及其伴隨的腸道菌群紊亂的關(guān)系。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究通過校正BMI，擬探討PCOS患者腸道菌群結(jié)構(gòu)變化與NPY水平之間的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 對(duì)前期研究數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，匹配兩組患者年齡，最后選取2014年1月—2016年6月在上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科和婦產(chǎn)科就診的PCOS患者21例納入PCOS組，在社區(qū)招募健康育齡期女性13例納入對(duì)照組。PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)，滿足以下3點(diǎn)中的2點(diǎn)即診斷為PCOS：①高雄激素的臨床表現(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室檢查結(jié)果；②稀發(fā)排卵或不排卵；③卵巢多囊樣表現(xiàn)。同時(shí)需排除先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、產(chǎn)生雄激素的腫瘤、庫欣綜合征等其他病因[14]。所有入選者均為BMI≥18 kg/m2的育齡期女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：3個(gè)月內(nèi)接受抗生素治療者，妊娠期或哺乳期女性，合并其他可能引起高雄激素血癥和排卵障礙的疾病，3個(gè)月內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素、性激素或降糖藥物等，患有肝病或腎病等其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病，有酗酒等其他不良嗜好。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)(審批號(hào)2014KY091)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 樣本采集 收集所有受試者的基礎(chǔ)臨床資料，禁食8～12 h后留取空腹血液樣本，并進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，留取服糖后2 h的血液樣本。多毛評(píng)分采用Ferriman-Gallway毛發(fā)評(píng)分法。應(yīng)用ELISA試劑盒(EZHNPY-25K,美國EMD Millipore公司)檢測(cè)血清NPY水平。體格檢查當(dāng)天使用無菌容器留取中段糞便，迅速干冰凍存后-80 ℃保存，用于下一步檢測(cè)分析。

1.3 糞便DNA提取和16S rRNA V3-V4區(qū)測(cè)序 糞便樣本DNA提取采用Godon 等[15]的方法。使用Miseq試劑盒V3 (600-cycle) (MS-102-3033,美國Illumina公司)在Illumina Miseq平臺(tái)(美國Illumina公司)對(duì)所有樣本進(jìn)行測(cè)序。16S rRNA V3-V4區(qū)測(cè)序方法參照Illumina的官方操作指南 (Part#15044223 Rev. B)進(jìn)行，并根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行部分修改。

1.4 高通量數(shù)據(jù)處理 根據(jù)Zhang等[16]的描述，對(duì)獲得的序列進(jìn)行質(zhì)量控制，利用Usearch軟件(Usearch 8.0.1623_i86 linux32)劃分操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)，相似度為100%的序列被劃分為單一序列(unique sequence)，按豐度排序，去除豐度為1的單一序列，去除嵌合體，相似度≥97%的序列劃分為1個(gè)OTU。

2 結(jié) 果

2.1 臨床一般資料 PCOS組BMI、腰圍、腰臀比、餐后2 h血糖(2hPG)、餐后2 h胰島素(2hINS)、HbA1c、TG、黃體生成素(LH)、LH/卵泡刺激素(FSH)、睪酮水平和多毛評(píng)分均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)，NPY水平顯著低于對(duì)照組(P<0.001)。兩組間年齡、FSH、FBG、空腹胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、TC的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表1。

表1 對(duì)照組與PCOS組的基礎(chǔ)臨床資料比較

2.2 NPY水平與臨床資料的相關(guān)性分析 校正BMI后，偏相關(guān)分析結(jié)果顯示，機(jī)體血清NPY水平與LH/FSH、睪酮、多毛評(píng)分均呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.420、-0.449、-0.398，P=0.017、0.009、0.022),NPY水平與FINS呈顯著正相關(guān)(r=0.396,P=0.022)。見表2。

表2 校正BMI 后NPY與臨床因素的偏相關(guān)分析

2.3 組間腸道菌群結(jié)構(gòu)差異 檢測(cè)兩組患者的腸道菌群，經(jīng)LEfSe共挑選出12個(gè)對(duì)PCOS組和對(duì)照組腸道菌群結(jié)構(gòu)造成差異的關(guān)鍵OTU。兩組比較，對(duì)照組有9個(gè)OTU相對(duì)豐度顯著增加，主要來自瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、柯林斯菌屬(Collinsella)和普氏菌屬(Prevotella)等；而PCOS組有3個(gè)OTU相對(duì)豐度顯著增多，主要來自擬桿菌屬(Bacteriodes)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)等。見圖1和表3。

表3 LEfSe分析特征

紅色表示在對(duì)照組中豐度增多，綠色表示在PCOS組中豐度增多；條形長短代表顯著差異OTU的影響程度圖1 兩組間關(guān)鍵OTU的LDA值分布圖

2.4 腸道菌群與NPY的相關(guān)性分析 進(jìn)一步分析關(guān)鍵OTU豐度與NPY的相關(guān)性。校正BMI后，偏相關(guān)分析結(jié)果顯示，NPY與來自霍爾德曼菌屬(Holdemanella)、柯林斯菌屬和普氏菌屬的3個(gè)OTU相對(duì)豐度均呈顯著正相關(guān)，與來自毛螺菌科和擬桿菌屬的3個(gè)OTU相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P值分別<0.01,0.05)。見表4。

表4 校正BMI后關(guān)鍵OTU與NPY的偏相關(guān)分析

3 討 論

PCOS是一種育齡期女性常見的復(fù)雜內(nèi)分泌代謝性疾病，其具有終生傾向、全身代謝紊亂的特點(diǎn)，常伴有生殖內(nèi)分泌功能紊亂、體脂分布異常、糖脂代謝異常和胰島素抵抗等，而其基本的病理生理變化尚未完全明確，一般認(rèn)為與遺傳和環(huán)境因素相關(guān)。過去10年中，全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，類固醇激素合成、下丘腦-垂體通路、促性腺激素作用、胰島素分泌及其功能、脂肪組織紊亂、穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝和慢性炎癥都可能是參與PCOS發(fā)病的因素[2]。腸道菌群作為人體內(nèi)龐大的微生物群，其基因組編碼的基因數(shù)量是人類自身基因組的100～150倍，可被視為人體“內(nèi)化了的環(huán)境”因素，其地位與作用相當(dāng)于后天獲得的一個(gè)重要“器官”[17-18]。腸道菌群參與機(jī)體代謝和免疫等功能，其紊亂可導(dǎo)致PCOS等多種疾病發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，毛螺菌科在PCOS患者中顯著富集，而霍爾德曼菌屬和普氏菌屬等在PCOS患者中被顯著抑制。此外，本課題組的前期研究采用冗余分析(redundancy analysis,RDA)發(fā)現(xiàn)，PCOS患者腸道菌群物種豐富度較非肥胖健康女性顯著降低，存在顯著腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂，并鑒定出28個(gè)對(duì)4組腸道菌群結(jié)構(gòu)造成差異的關(guān)鍵OTU，擬桿菌屬在PCOS患者中顯著富集，而疣微菌科和柯林斯菌屬在PCOS患者中受到顯著抑制[11]。本研究結(jié)果與該研究及之前的研究[7,11,19-21]結(jié)果相似。

本研究中，PCOS患者NPY水平顯著降低，且表現(xiàn)出與LH/FSH、睪酮水平和多毛評(píng)分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測(cè)NPY可能參與調(diào)控PCOS生殖內(nèi)分泌激素的產(chǎn)生。NPY是腦腸肽的一種，與腸道菌群對(duì)機(jī)體炎癥、腦功能和攝食行為等影響有關(guān)[21]。NPY/AgRP神經(jīng)信號(hào)通路可以影響促黃體素釋放激素(GnRH)/LH脈沖的產(chǎn)生，減少LH分泌[22]。此外，NPY/AgRP神經(jīng)信號(hào)通路可能影響雄激素受體表達(dá)[23]。因此，PCOS患者NPY水平降低可能與其生殖內(nèi)分泌紊亂密切相關(guān)。

本研究進(jìn)一步分析PCOS患者腸道菌群結(jié)構(gòu)與NPY的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在顯著相關(guān)關(guān)系。目前研究[6-7,11]結(jié)果表明，腸道菌群失調(diào)或改善可通過調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥狀態(tài)、腸-腦軸等途徑影響PCOS的發(fā)病。根據(jù)既往的研究[6,11]得知，腸道菌群可通過富集產(chǎn)短鏈脂肪酸(SCFA)的細(xì)菌產(chǎn)生SCFA，從而促進(jìn)ghrelin和PYY等分泌，繼而作用于宿主腸-腦軸，調(diào)節(jié)性激素分泌。PYY和NPY作為PP-折疊蛋白家族，前者直接由腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌，然而腸道菌群如何調(diào)控產(chǎn)生NPY，以及兩者及機(jī)體大腦之間的相互作用有待進(jìn)一步探討[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在PCOS患者中NPY水平與被抑制的霍爾德曼菌屬、柯林斯菌屬和普氏菌屬等細(xì)菌豐度呈顯著正相關(guān)，而與被富集的毛螺菌科和擬桿菌屬豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。Narmaki等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，予多菌株混合益生菌干預(yù)后，肥胖女性患者血清NPY水平顯著升高。以上提示，腸道菌群中特定菌株可能與人體NPY水平密切相關(guān)。

綜上所述，PCOS患者血清NPY水平顯著降低，且與PCOS患者生殖內(nèi)分泌紊亂密切相關(guān)。PCOS患者腸道菌群中某些特定菌株可能與NPY水平相關(guān)。因此，PCOS患者失調(diào)的腸道菌群可能通過影響機(jī)體NPY水平，進(jìn)而參與調(diào)控機(jī)體的病理生理過程，干預(yù)PCOS患者腸道菌群結(jié)構(gòu)或NPY水平。上述結(jié)論或可為PCOS的臨床防治提供新思路。

本研究為PCOS患者腸道菌群結(jié)構(gòu)與NPY相關(guān)關(guān)系的初步探索，存在一定的局限性：本研究樣本量較小，未來需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證該結(jié)論；NPY與腸道菌群、大腦之間的相互作用機(jī)制仍未明確，有待更加完善的臨床和基礎(chǔ)研究探討、闡明。