楊壽娟，黃國鵬，任青竹，蔣云川

原發(fā)性膽囊癌發(fā)病率在膽囊惡性腫瘤中占第1位，女性發(fā)病率比男性高2～4倍，常見發(fā)病年齡為50～70歲[1-2]。膽囊癌的侵襲性很強，在早期無明顯的癥狀、體征，典型的晚期臨床癥狀表現(xiàn)為腹痛、腹部腫塊、黃疸、嘔吐、腹水[3]。手術(shù)切除是膽囊癌最主要治療手段，但復(fù)發(fā)率高，手術(shù)療效有限，預(yù)后不佳[4]。大量證據(jù)表明，手術(shù)中應(yīng)用的麻醉藥物類型可能影響患者的長期預(yù)后結(jié)果[5]。有研究表明，手術(shù)過程中采用局部麻醉聯(lián)合全身麻醉能減少癌癥的復(fù)發(fā)風(fēng)險，并改善總生存率[6]。還有研究表明，局部麻醉可以減少各種癌癥手術(shù)患者的腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[7]。布比卡因是與酰胺相關(guān)的局部麻醉劑，常用于緩解癌癥患者在手術(shù)中和術(shù)后的疼痛。相關(guān)研究表明，布比卡因能抑制結(jié)直腸腺癌細胞的增殖和遷移，并增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[8]。在卵巢癌中布比卡因能通過激活內(nèi)源性和外源性凋亡通路起到直接的抗癌作用，但在前列腺癌中僅能激活內(nèi)源性凋亡通路[9]。已有臨床研究表明，布比卡因具有直接的抗癌活性，能夠抑制胃癌的侵襲能力[10]?；谝陨辖Y(jié)論，本研究旨在評估布比卡因?qū)δ懩野〨BC-SD細胞增殖、侵襲、間質(zhì)轉(zhuǎn)換和微管形成的影響,報告如下。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)及處理 膽囊癌GBC-SD細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃條件下進行培養(yǎng)。各實驗組將鹽酸布比卡因等滲溶液(Marcaine，0.5% W/V，AstraZeneca，Luton，UK)用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度，同時對照組將相同比例的磷酸鹽緩沖液加入培養(yǎng)基,對膽囊癌GBC-SD細胞進行處理。

1.2CCK-8法檢測細胞活性 在96孔板中，將膽囊癌GBC-SD細胞分別用不同濃度布比卡因(0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L)處理24 h時，然后向每孔加入10 μl的CCK-8溶液。最后用酶聯(lián)免疫分析儀在450 nm處測量吸光度。以各濃度處理組細胞吸光度與0.15 mmol/L組細胞吸光度的比值表示細胞活性。

1.3克隆形成實驗 將不同濃度布比卡因處理及對照組膽囊癌GBC-SD細胞接種在6孔板中，培養(yǎng)14 d后，棄去培養(yǎng)基，將細胞用乙醇固定30 min，并用0.5%結(jié)晶紫染色。最后，將細胞用去離子水沖洗以干燥，并拍攝照片。

1.4Western blot檢測 將不同濃度布比卡因處理及對照組膽囊癌GBC-SD細胞，用裂解緩沖液裂解，在4 ℃條件下，14 000 r/min離心15 min。濃縮蛋白質(zhì)濃度用BCA試劑盒進行測量(上海碧云天生物有限公司)。取20 μg總蛋白在12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜在37 ℃下用5%牛血清白蛋白封閉1 h，然后加入抗p21、Survivin、Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，在4 ℃條件下過夜。用TTBS緩沖液洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)37 ℃反應(yīng)1 h；洗膜后ECL曝光成像并應(yīng)用quantity one軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.5Transwall實驗 將不同濃度布比卡因處理及對照組膽囊癌GBC-SD細胞以5×104/200 μl接種在Transwell小室上部，使用不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。下腔室充滿含10%胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基。孵育24 h后，將下腔室中的細胞在95%乙醇中固定，用蘇木精染色。使用倒置顯微鏡拍照(×100)，采用Image-Pro Plus分析軟件計數(shù)遷移過膜的細胞。

1.6微管形成實驗 將Matrigel人工基質(zhì)膠稀釋后平鋪于24孔板底部，將不同濃度布比卡因處理的膽囊癌GBC-SD細胞以5×104/200 μl接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)16 h，每隔4 h觀察微管樣結(jié)構(gòu)形成情況。使用倒置顯微鏡隨機拍照(×100)，采用MicrovisionSaisam軟件分析微管形成結(jié)節(jié)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1布比卡因?qū)δ懩野〨BC-SD細胞活性的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，隨著布比卡因濃度的增加，膽囊癌GBC-SD細胞活性顯著下降(P<0.05)。與1.25 mmol/L比較，2.5和5 mmol/L布比卡因處理后細胞活性顯著下調(diào)(P<0.05)，與2.5 mmol/L比較，5 mmol/L布比卡因處理后細胞活性顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖1。本研究選擇布比卡因濃度為1.25、2.5、5 mmol/L進行后續(xù)實驗。

2.2布比卡因?qū)δ懩野〨BC-SD細胞增殖的影響 克隆形成實驗結(jié)果顯示，1.25 mmol/L組細胞克隆形成比率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組和1.25 mmol/L組比較，2.5 mmol/L組和5 mmol/L組細胞克隆形成比率顯著下調(diào)(P<0.01)。與2.5mmol/L組比較，5 mmol/L組細胞克隆形成比率顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖2。

2.3布比卡因?qū)δ懩野〨BC-SD細胞p21、Survivin、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，1.25 mmol/L組p21、Survivin蛋白表達量和Bax/Bcl-2比率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組和1.25 mmol/L組比較，2.5 mmol/L組和5 mmol/L組p21蛋白表達量和Bax/Bcl-2比率顯著上調(diào)，而Survivin蛋白表達量顯著下調(diào)(P<0.01)。與2.5 mmol/L組比較，5 mmol/L組p21蛋白表達量和Bax/Bcl-2比率顯著上調(diào)，而Survivin蛋白表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖3。

2.4布比卡因?qū)δ懩野〨BC-SD細胞侵襲力的影響 Transwell實驗結(jié)果顯示，1.25 mmol/L組細胞侵襲力與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組和1.25 mmol/L組比較，2.5 mmol/L組和5 mmol/L組細胞侵襲力顯著降低(P<0.01)。與2.5 mmol/L組比較，5 mmol/L組細胞侵襲力顯著降低(P<0.05)。見圖4。

2.5布比卡因?qū)δ懩野〨BC-SD細胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，1.25 mmol/L組E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組和1.25 mmol/L組比較，2.5 mmol/L組和5 mmol/L組N-cadherin和Vimentin蛋白表達量顯著下調(diào)，而E-cadherin蛋白表達量顯著上調(diào)(P<0.05)。與2.5 mmol/L組比較，5 mmol/L組N-cadherin和Vimentin蛋白表達量顯著下調(diào)，而E-cadherin蛋白表達量顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖5。

2.6布比卡因?qū)δ懩野〨BC-SD細胞微管形成及VEGF蛋白表達的影響 微管形成實驗結(jié)果顯示，1.25 mmol/L組微管形成結(jié)節(jié)數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組和1.25 mmol/L組比較，2.5 mmol/L組和5 mmol/L組微管形成結(jié)節(jié)數(shù)降低(P<0.05)。與2.5 mmol/L組比較，5 mmol/L組微管形成結(jié)節(jié)數(shù)降低(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示，1.25 mmol/L組VEGF蛋白表達量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組和1.25 mmol/L組比較，2.5 mmol/L組和5 mmol/L組VEGF蛋白表達量下調(diào)(P<0.05)。與2.5 mmol/L組比較，5 mmol/L組VEGF蛋白表達量下調(diào)(P<0.05)。見圖6。

3 討論

膽囊癌是膽道最常見的惡性腫瘤，也是第6常見的胃腸道癌癥[11]。布比卡因是一種常用的局部麻醉劑。本研究旨在評估布比卡因?qū)δ懩野〨BC-SD細胞增殖、侵襲和微管形成的影響。

克隆形成實驗結(jié)果表明，布比卡因處理后，膽囊癌GBC-SD細胞克隆形成比率顯著降低。p21作為細胞周期抑制因子和抗增殖效應(yīng)因子在體內(nèi)發(fā)揮重要作用[12]。Survivin是細胞周期G2/M期表達的凋亡抑制蛋白，參與細胞分裂，影響細胞存活和增殖，可在大多數(shù)人類腫瘤組織中表達，但在正常分化的組織中不表達[13]。Bax/Bcl-2-p53表達增加能夠?qū)θ四X膠質(zhì)瘤細胞的增殖起到抑制作用[14]。有研究表明，布比卡因能抑制胃癌細胞活性、轉(zhuǎn)移和糖酵解過程，促進胃癌細胞凋亡[15]。本實驗中，布比卡因處理后，膽囊癌GBC-SD細胞p21蛋白表達量和Bax/Bcl-2比率顯著上調(diào)，而Survivin蛋白表達量顯著下調(diào)。上述結(jié)果表明布比卡因能夠抑制膽囊癌GBC-SD細胞增殖。

Transwell實驗結(jié)果表明，布比卡因處理后，膽囊癌GBC-SD細胞侵襲力顯著降低。E-cadherin是腫瘤抑制蛋白，其在腫瘤細胞中的表達與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，E-cadherin表達的缺失能夠促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移[16]。N-cadherin的異常表達與人類惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化、黏附、凋亡、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面密切相關(guān)[17]。Vimentin是正常生理條件下間充質(zhì)細胞可塑性以及發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化癌細胞遷移所必需的因子[18]。布比卡因能有效抑制卵巢癌和前列腺癌腫瘤細胞的增殖能力和遷移率[19]。本實驗結(jié)果顯示，布比卡因處理后，膽囊癌GBC-SD細胞N-cadherin和Vimentin蛋白表達量顯著下調(diào)，而E-cadherin蛋白表達量顯著上調(diào)。上述結(jié)果表明布比卡因能夠抑制膽囊癌GBC-SD細胞侵襲能力。

微管形成實驗結(jié)果表明，布比卡因處理后，膽囊癌GBC-SD細胞微管形成結(jié)節(jié)數(shù)顯著降低，VEGF蛋白表達量顯著下調(diào)。VEGF是一種關(guān)鍵的血管生成因子，能夠為腫瘤定向毛細血管網(wǎng)的持續(xù)生長創(chuàng)造有利條件，促進了腫瘤的生長、進展和轉(zhuǎn)移[20]。多種阻斷VEGF藥物的研發(fā)目的是抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[21]。上述研究表明，布比卡因具有抑制膽囊癌GBC-SD細胞微管形成和VEGF蛋白表達的作用。

綜上所述，布比卡因具有抑制膽囊癌GBC-SD細胞增殖、侵襲和微管形成的作用。本研究僅為體外細胞實驗和機制的初步探討，體內(nèi)試驗有待進一步研究。