談 理，楊洪光，鄭 波，楊曉瑜

肝硬化是一種或多種病因引起的慢性進(jìn)行性肝病，主要以肝功能損傷及門靜脈高壓為特點(diǎn)，晚期常引起上消化道出血等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生命安全[1]。既往研究表明，肝硬化患者上消化道出血6周后的病死率高達(dá)15%[2]，且40%～70%因首次出血死亡[3]，積極尋找疾病診斷及預(yù)后評估的相關(guān)指標(biāo)是制定個體化治療方案，降低病死率的關(guān)鍵。肝硬化患者肝功能顯著下降，加之上消化道出血及腹腔積液刺激，使免疫功能明顯降低[4]。miR-130a是一種內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，可通過選擇性結(jié)合靶基因上的信使RNA，起到抑制基因表達(dá)的作用[5]?，F(xiàn)有研究已表明，miR-130a可參與細(xì)胞凋亡、分化、組織發(fā)育等生理過程，還能有效調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)[6]。但miR-130a是否與肝硬化上消化道出血病情及預(yù)后有關(guān)，目前相關(guān)報道較少。據(jù)此，本文探究肝硬化上消化道出血患者血清miR-130a表達(dá)情況及與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的相關(guān)性，旨在為發(fā)病機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月—2020年1月于我院就診的肝硬化208例。①納入標(biāo)準(zhǔn)：肝硬化符合《肝硬化診治指南》[7]中代償期或失代償期肝硬化相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；上消化道出血患者伴有嘔血、黑便及大便隱血試驗陽性，且經(jīng)胃鏡證實；年齡>18歲；患者及其家屬對本研究知情，并簽署知情同意書。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并缺鐵性貧血、巨幼紅細(xì)胞性貧血、自身免疫性溶血性貧血等血液系統(tǒng)疾病者；口、鼻、咽部出血者；合并惡性腫瘤者；近期服用影響凝血功能藥物者；合并腎衰竭、急性感染性疾病者。另選擇同期健康體檢的志愿者57例為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2研究方法

1.2.1臨床資料收集：記錄肝硬化患者入院時及對照組體檢當(dāng)天的一般資料，對所有肝硬化患者進(jìn)行6個月的出院隨訪，并記錄死亡情況。一般資料包括姓名、性別、病程、病因等，實驗室檢測血液相關(guān)指標(biāo)包括血小板(PLT)、白蛋白(ALB)、凝血功能[凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(FIB)、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)]等，終末期肝病模型(MELD)評分應(yīng)用公式計算，MELD=9.6×In(肌酐mg/dl)+3.8×In(膽紅素mg/dl)+11.2×In(INR)+6.4×病因，公式中病因為膽汁淤積或酒精性肝炎均記0分，其他病因記1分，得分越高，表示其風(fēng)險越大。

1.2.2血清miR-130a檢測：采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測血清miR-130a相對表達(dá)量，具體步驟如下：①血清樣本提取：采集空腹靜脈血10 ml，置于無菌采血管，離心后取上清液-80 ℃超低溫冷凍保存；②總RNA提?。喝?80 μl血清樣本，加入1 ml總RNA提取試劑Trizol液(Invitrogen，Grand Island，NY)，振蕩器混勻，室溫下靜置5 min；加入0.2 ml三氯甲烷，振蕩器混勻15 s，室溫下靜置10 min；4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min；吸取上層水相液體至新的1.5 ml EP管，加入1 ml異丙醇，振蕩器混勻，室溫下靜置10 min；4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入75%乙醇1 ml，輕輕搖動；4 ℃條件下離心5 min，棄去上清液，在室溫下干燥或真空干燥5 min，加入焦碳酸二乙酯30 μl，待其溶解后置于-80 ℃低溫冰箱中保存。③RNA質(zhì)量檢測：使用NanoDrop 8000紫外-可見光分光光度計進(jìn)行RNA濃度檢測，比值為1.8～2.0。④qRT-PCR分析：參考GenBank數(shù)據(jù)獲取待測基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件分析，引物濃度0.4 μmol/L，RNA模板0.6 μl，93 ℃預(yù)變性5 min，93 ℃變性40 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，共40個循環(huán)；每個待測樣本設(shè)置3個平行樣本，以β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計合成相應(yīng)上下游引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt進(jìn)行miR-130a基因相對表達(dá)量的計算。miR-130a正向引物：5'-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3'，反向引物：5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'；β-actin正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.3分組方法：①根據(jù)是否合并上消化道出血將肝硬化患者分為出血組90例與無出血組118例；②根據(jù)肝功能Child分級評分將出血組分為A級組13例、B級組26例、C級組51例，其中A級：得分5～6分，B級：得分7～9分，C級：得分10～15分[8]；③根據(jù)上消化道出血嚴(yán)重程度分級將出血組分為輕度組34例、中度組45例、重度組11例，其中輕度：失血量<500 ml，血壓、心率、血紅蛋白基本正常，僅頭暈，休克指數(shù)(心率/收縮壓)0.5；中度：失血量500～1000 ml，血壓下降，心率>100/min，血紅蛋白70～100 g/L，出現(xiàn)暈厥、口渴等癥狀，休克指數(shù)1.0；重度：失血量>1500 ml，收縮壓<80 mmHg，心率>120/min，血紅蛋白<70 g/L，出現(xiàn)四肢發(fā)冷、意識模糊等癥狀，休克指數(shù)1.5[9]。

1.3觀察指標(biāo) 比較所有研究對象的臨床資料，比較各組血清miR-130a相對表達(dá)量，分析血清miR-130a表達(dá)對肝硬化患者上消化道出血的評估價值，以及肝硬化上消化道出血患者血清miR-130a表達(dá)與肝功能分級、出血嚴(yán)重程度的相關(guān)性。以肝硬化上消化道出血患者住院期間或出院6個月內(nèi)死亡作為預(yù)后終點(diǎn)，評估影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。

2 結(jié)果

2.1一般資料比較 3組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。出血組病因、PLT、PT、TT、INR與無出血組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。出血組病程、APTT、FIB、肝功能Child分級評分、MELD評分、血清miR-130a表達(dá)水平高于無出血組，ALB低于無出血組(P<0.05)。出血組和無出血組PT、APTT、TT、FIB、INR、血清miR-130a表達(dá)水平高于對照組，ALB、PLT低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 肝硬化合并、未合并上消化道出血患者和健康體檢志愿者3組的一般資料比較

2.2血清miR-130a表達(dá)對肝硬化患者上消化道出血的評估價值 血清miR-130a表達(dá)水平評估肝硬化患者上消化道出血的最佳截斷值為7.3，曲線下面積為0.861(95%CI：0.806，0.905)，對應(yīng)的敏感度、特異度分別為83.90%、77.78%。見圖1。

2.3不同肝功能分級肝硬化上消化道出血患者血清miR-130a表達(dá)水平比較 A級組血清miR-130a表達(dá)水平為7.12±1.26，B級組為9.12±2.04，C級組為13.26±3.24。A級組血清miR-130a表達(dá)水平低于B級組和C級組，且B級組低于C級組(P<0.05)。

2.4不同出血嚴(yán)重程度肝硬化上消化道出血患者血清miR-130a表達(dá)水平比較 輕度組血清miR-130a表達(dá)水平為7.44±1.83，中度組為8.86±1.46，重度組11.12±0.97。輕度組血清miR-130a表達(dá)水平低于中度組和重度組，且中度組低于重度組(P<0.05)。

2.5相關(guān)性分析 肝硬化上消化道出血患者血清miR-130a表達(dá)與肝功能分級及出血嚴(yán)重程度均呈顯著正相關(guān)性(r=0.451、0.527，P均<0.001)。

2.6單因素Cox回歸模型分析 本組肝硬化上消化道出血患者住院期間或出院6個月內(nèi)死亡21例，以死亡作為預(yù)后終點(diǎn)。單因素分析顯示，病程、肝功能Child分級評分、MELD評分、血清miR-130a表達(dá)水平是影響肝硬化上消化道出血患者預(yù)后的相關(guān)因素(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 影響肝硬化上消化道出血患者預(yù)后的單因素Cox回歸模型分析

2.7多因素Cox回歸模型分析 將上述單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)納入多因素分析，結(jié)果顯示，病程、肝功能Child分級評分及血清miR-130a表達(dá)水平是影響肝硬化上消化道出血患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P<0.01)。見表3。

表3 影響肝硬化上消化道出血患者預(yù)后的多因素Cox回歸模型分析

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為在肝硬化代償期時，隨著肝功能的下降及側(cè)支循環(huán)的不斷開放，出現(xiàn)門靜脈高壓癥狀，表現(xiàn)為門靜脈內(nèi)徑增寬及食管、胃底靜脈曲張等特征。隨著肝硬化患者病情加重，逐漸從代償期過渡到失代償期，門靜脈高壓繼續(xù)加重，在各種因素的影響下極易引起上消化道出血[10-11]。另外，隨著病程的延長，肝硬化患者肝功能損傷程度逐漸加重，導(dǎo)致其凝血功能紊亂及ALB等生化指標(biāo)異常[12]。本研究結(jié)果顯示，出血組病程、APTT、FIB、肝功能Child分級評分、MELD評分、血清miR-130a表達(dá)水平高于無出血組，ALB低于無出血組；出血組和無出血組PT、APTT、TT、FIB、INR、血清miR-130a表達(dá)水平高于對照組，ALB、PLT低于對照組。提示肝硬化患者上述指標(biāo)出現(xiàn)明顯異常，其中部分指標(biāo)可能提示上消化道出血的發(fā)生，而肝功能Child分級評分、MELD評分可在一定程度上反映患者病情嚴(yán)重程度。另外，ROC曲線結(jié)果表明血清miR-130a表達(dá)水平可作為評估肝硬化患者發(fā)生上消化道出血的有效指標(biāo)。

目前，臨床有關(guān)肝硬化患者并發(fā)上消化道出血的危險因素研究較多，但因樣本納入標(biāo)準(zhǔn)及分析方法不同，國內(nèi)外研究結(jié)果亦存在爭議[13-14]。周思舉[15]研究認(rèn)為，肝硬化患者發(fā)生上消化道出血是由于肝功能降低引起的凝血功能障礙及腹腔積液等出血刺激因素；同時由于患者免疫系統(tǒng)紊亂，極易導(dǎo)致院內(nèi)感染率升高。miR-130a是具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能的關(guān)鍵因子，能在機(jī)體抗感染過程中起到重要作用[16]。大量研究已證實，miR-130a與急性冠狀動脈綜合征、顱腦損傷等疾病具有明顯的相關(guān)性[17-18]。薛揚(yáng)和郭宏強(qiáng)[19]研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒相關(guān)慢加急性(亞急性)肝衰竭患者血清miR-130a表達(dá)水平較健康體檢者異常升高，考慮可能與誘導(dǎo)免疫細(xì)胞因子的釋放有關(guān)。另外，本研究結(jié)果還顯示，A級組血清miR-130a表達(dá)水平低于B級組和C級組，且B級組低于C級組；輕度組血清miR-130a表達(dá)水平低于中度組和重度組，且中度組低于重度組；肝硬化上消化道出血患者血清miR-130a表達(dá)與肝功能分級及出血嚴(yán)重程度均呈明顯正相關(guān)性。提示血清miR-130a表達(dá)能反映肝硬化上消化道出血患者的肝功能及出血嚴(yán)重程度。動物及細(xì)胞學(xué)研究證明，miR-130a可參與多種病因?qū)е碌母嗡ソ甙l(fā)病過程，且能反映肝功能的損傷程度[20]。肝硬化患者升高的miR-130a表達(dá)水平與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶等互相影響，從而加重病情發(fā)展。

有研究表明，miR-130a在人類獲得性免疫及固有免疫中均具有至關(guān)重要的作用，主要通過靶基因蛋白對自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用[19]。但miR-130a在肝硬化患者中的研究相對較少，與患者預(yù)后相關(guān)的分析報道也極少見。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病程、肝功能Child分級評分及血清miR-130a表達(dá)水平是影響肝硬化上消化道出血患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。隨著肝硬化患者病情的加重，門靜脈高壓癥狀越發(fā)嚴(yán)重，導(dǎo)致食管、胃底靜脈曲張，極易破裂出血，危及患者生命安全。miR-130a可有效調(diào)控患者淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的活性，并參與炎癥反應(yīng)，加強(qiáng)藥物對病變細(xì)胞的殺傷力，還可促進(jìn)淋巴細(xì)胞與肝臟病變組織結(jié)合，從而建立反應(yīng)灶，但其相對表達(dá)量升高提示病情嚴(yán)重程度增加，因而患者預(yù)后相對較差。

綜上所述，肝硬化上消化道出血患者miR-130a表達(dá)水平顯著升高，并與肝功能及出血嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)性。從分子水平研究與肝硬化上消化道出血發(fā)病相關(guān)的基因，對病情評估及治療具有重要的臨床意義。