于 堃，劉瑞莉，劉賢勛，柏學(xué)進(jìn)，董雅娟，3

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省黑牛繁育工程技術(shù)研究中心，山東 青島 266109；3.山東布萊凱特黑牛科技股份有限公司，山東 淄博 256306)

肉牛是畜牧業(yè)中重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，骨骼肌的生長發(fā)育不僅會(huì)影響肉牛的產(chǎn)肉量，還會(huì)對(duì)牛肉品質(zhì)有一定的影響，進(jìn)而改變食用口感。因此，調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育過程、增加肌肉量是肉牛遺傳育種工作的主要研究內(nèi)容。當(dāng)前，越來越多的研究集中在動(dòng)物骨骼肌生長發(fā)育的機(jī)理上，在這一過程中，microRNAs(miRNAs)的研究為熱點(diǎn)。

miRNAs是一類進(jìn)化上保守的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，長度約為18～22個(gè)堿基，廣泛存在于動(dòng)物、植物以及病毒等生物的基因組中，通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，成為許多生物過程的重要調(diào)節(jié)因子。研究證明，家畜骨骼肌發(fā)育的幾乎所有方面都涉及miRNAs的調(diào)控，包括細(xì)胞遷移、增殖、分化和凋亡等[1]。已有研究表明，許多miRNAs以組織特異性或階段特異性的方式表達(dá)，而最具特征的肌肉特異性miRNAs是miR-1、miR-206和miR-133家族，它們?cè)谛募『凸趋兰≈刑禺愋员磉_(dá)，在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。Safa等[3]研究報(bào)道，miR-1可通過靶向PAX7和HDAC4的3′UTR區(qū)，抑制PAX7和HDAC4基因的表達(dá)，促進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的肌原性分化。過表達(dá)miR-1/miR-206，可以使TNF-α表達(dá)下調(diào)，降低其對(duì)成肌細(xì)胞分化的抑制程度[4]。Mok等[5]研究表明，miR-133靶向調(diào)控Hedgehog通路中Gli3基因，抑制miR-133表達(dá)會(huì)破壞細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和上皮化，進(jìn)而損害肌節(jié)的形成和生長，調(diào)控胚胎肌肉發(fā)生。miR-133通過抑制山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞HDAC4和SRF基因的翻譯，參與調(diào)控山羊骨骼肌細(xì)胞增殖和分化過程[6]，通過調(diào)控TGFBR1的表達(dá)，參與鴨成肌細(xì)胞的增殖分化[7]。miR-133a通過靶向BIRC5基因，抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡，影響肌肉質(zhì)量[8]。此外，有的研究報(bào)道，miR-133a可通過降解生長激素基因的轉(zhuǎn)錄抑制子-胰島素樣生長因子 1(IGF1)，進(jìn)而造成肌肉肥大等異?，F(xiàn)象[9]。

目前，研究雖然證實(shí)了bta-miR-133a參與調(diào)控骨骼肌的生長發(fā)育，但并未見bta-miR-133a調(diào)控靶基因參與成肌細(xì)胞增殖與分化過程的直接相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室(動(dòng)物胚胎工程中心)選用布萊凱特黑牛和魯西黃牛背最長肌構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序的sRNA數(shù)據(jù)庫[10-11]，布萊凱特黑牛是運(yùn)用體細(xì)胞克隆技術(shù)、超數(shù)排卵技術(shù)、胚胎分割及胚胎冷凍技術(shù)以及雜交育種與分子標(biāo)記輔助育種的方法培育而成的優(yōu)良肉牛新種質(zhì)[12-13]；魯西黃牛是我國優(yōu)秀的地方良種，素有“五花三層肉”和“山東膘牛”的美稱。本試驗(yàn)基于布萊凱特黑牛和魯西黃牛的數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)bta-miR-133a的靶基因，分析其保守性，并對(duì)靶基因進(jìn)行GO富集和KEGG通路富集分析，篩選并確定目標(biāo)miRNA(bta-miR-133a)；以C2C12細(xì)胞作為細(xì)胞模型進(jìn)行功能驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染bta-miR-133a 模擬劑、模擬劑陰性對(duì)照、bta-miR-133a抑制劑和抑制劑陰性對(duì)照，2%馬血清誘導(dǎo)分化，檢測(cè)靶基因和增殖分化標(biāo)志性基因的表達(dá)量變化，探究bta-miR-133a通過調(diào)控靶基因參與肉牛骨骼肌發(fā)育過程的分子機(jī)制，旨在為揭示bta-miR-133a調(diào)節(jié)肉牛骨骼肌生長發(fā)育的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，為肉牛肉質(zhì)性狀的分子選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

選取的12月齡布萊凱特黑牛和魯西黃牛各3頭，采集背最長肌組織置于液氮保存。小鼠C2C12細(xì)胞系和bta-miR-133a轉(zhuǎn)染載體，購自普健生物(武漢)科技有限公司；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa Bio USA；Lipofectamine 3000試劑，購自賽默飛世爾科技；CCK-8檢測(cè)試劑盒(CK04)，購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司。

1.2 小RNA文庫的構(gòu)建測(cè)序與質(zhì)量控制

用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總RNA，使用RIN≥7.0且A260/280的比值在0.8～2.0的高質(zhì)量RNA樣品，構(gòu)建序列文庫。采用Illumina Genome Analyzer對(duì)文庫進(jìn)行測(cè)序。原始測(cè)序數(shù)據(jù)由Fastp軟件處理，刪除包含適配器，ploy-N和低質(zhì)量讀取數(shù)據(jù)，獲得干凈原始讀取。所有下游分析均基于高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。通過比對(duì)分析軟件Bowtie 1.1.2(設(shè)置允許一個(gè)錯(cuò)配)將sRNA測(cè)序的干凈讀數(shù)定位到參考基因組(Bos_taurus.NCBI.795.1)進(jìn)行比對(duì)。

1.3 bta-miR-133a的生物信息學(xué)分析

為了探索 bta-miR-133a 的生物學(xué)功能，從miRBase(http：//www.mirbase.org/)檢索牛(Bostaurus，Bta)、人(Homosapiens，Hsa)、黑猩猩(Pantroglodytes，Ptr)、大鼠(Rattusnorvegicus，Rno)、小鼠(Musmusculus，Mmu)、馬(Equuscaballus，Eca)的miR-133a成熟序列，分析其保守性。使用 TargetScan 7.2(http：//www.targetscan.org/vert_72/)軟件對(duì)bta-miR-133a進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，以物種“cow”為背景，選擇目的miR-133a，Total context++score數(shù)值大小，代表miRNA與該靶基因結(jié)合的概率；根據(jù)Aggregate PCT，代表靶基因的保守定位可能性，獲得預(yù)測(cè)靶基因。使用DAVID 6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)和KOBAS 3.0(http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/)在線軟件對(duì)預(yù)測(cè)所有bta-miR-133a靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG 通路富集分析。使用DAVID 6.8上傳靶基因信息，選擇背景基因物種“Bostaurus”，使用“Functional Annotation Tool”選擇“KEGG_PATHWAY” 進(jìn)行通路富集分析。使用KOBAS 3.0中的“Gene-list Enrichment”，上傳基因信息，選擇“GO”數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能富集分析。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)

使用膠回收純化試劑盒(Shanghai Generay Biotech Co.，Ltd.)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，將膠回收產(chǎn)物連接在pSI-Check2載體上，連接產(chǎn)物經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞DH5α轉(zhuǎn)化后，37 ℃ 250 r/min搖菌14 h，用菌液進(jìn)行PCR鑒定，將陽性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序。構(gòu)建靶基因PAX7的雙熒光素酶突變載體。HEK-293T細(xì)胞在96孔板中避光接種培養(yǎng)，同時(shí)將DMEM、0.8 mg/mL轉(zhuǎn)染試劑(普健生物科技有限公司)、0.16 μgPAX7質(zhì)粒和0.5 μg bta-miR-133a或NC mimic共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞檢測(cè)。使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega Dual-Luciferase System)檢測(cè)雙熒光素酶活性。

1.5 成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)分化

正常培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞，吸棄原培養(yǎng)液，PBS洗后加入胰酶消化2 min后終止消化，剩余細(xì)胞懸液用培養(yǎng)基重懸，4 000個(gè)/孔(96孔板)進(jìn)行鋪板(200 μL)，3個(gè)復(fù)孔，5% CO2，37 ℃過夜培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，用Lipofectamine 3000試劑轉(zhuǎn)染濃度為20 μmol/L的空白組(Blank)、模擬劑陰性對(duì)照組(NC mimic)、bta-miR-133a模擬劑(bta-miR-133a mimic)、抑制劑陰性對(duì)照組(NC inhibitor)和bta-miR-133a抑制劑組(bta-miR-133a inhibitor)，轉(zhuǎn)染6 h后，換GM培養(yǎng)基，12 h后用 2%馬血清誘導(dǎo)分化，分別再培養(yǎng)24(1 d)，48(2 d)，120(5 d)，144 h(6 d)觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，48 h后提取細(xì)胞總RNA及總蛋白。

1.6 Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞增殖率檢測(cè)

轉(zhuǎn)染后24，48，72 h分別從培養(yǎng)箱中取出1個(gè)96孔板，向每孔中加入20 μL CCK8 溶液，培養(yǎng)4 h后，檢測(cè)450 nm處的OD值。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

隨機(jī)選取4個(gè)miRNAs(bta-miR-133a、bta-miR-196b、bta-miR-200b、bta-miR-11977)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證。檢測(cè)成肌細(xì)胞增殖分化標(biāo)志基因PCNA、CCND1、Myh1、Myod1和靶基因PAX7的表達(dá)量。使用TRIzol法提取空白組(Blank)、模擬劑陰性對(duì)照組(NC mimic)、bta-miR-133a模擬劑(bta-miR-133a mimic)、抑制劑陰性對(duì)照組(NC inhibitor)和bta-miR-133a抑制劑組(bta-miR-133a inhibitor)5組轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞總RNA。將提取的細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：RNA-free Water 7.8 μL，上游引物0.6 μL(10 μmol/L)，下游引物0.6 μL(10 μmol/L)，SYBRGreen mix 10 μL，cDNA 1 μL(80 ng/μL)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)[14-15]。以GAPDH作為內(nèi)參基因，對(duì)PAX7、PCNA、CCND1、Myh1、Myod1基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；以U6作為內(nèi)參，對(duì)bta-miR-196b、bta-miR-200b、bta-miR-11977、Novel_445、Novel_130、Novel_334進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，采用2-ΔΔCT值法計(jì)算。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見表1。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 20. 0 統(tǒng)計(jì)分析軟件中的One-way ANOVA進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 背最長肌組織中 miRNA的篩選

使用Illumina基因組分析儀系統(tǒng)測(cè)序后，構(gòu)建sRNA文庫。獲得原始數(shù)據(jù)，去除低質(zhì)量reads(質(zhì)量值低于20、堿基數(shù)超過1或含有N的reads)、不帶有3′接頭的reads、含有5′接頭的reads、插入片段缺失的reads和長度小于18 nt的reads以及含有polyA的reads(一條reads中大于70%的堿基都是A)后得到高質(zhì)量片段(clean reads)。通過比對(duì)分析軟件Bowtie(設(shè)置允許一個(gè)錯(cuò)配)將sRNA測(cè)序的clean reads定位到參考基因組上，共獲得26 061 624個(gè)clean reads。根據(jù)比對(duì)上參考序列的reads，與miRBase數(shù)據(jù)庫的牛物種的參考序列進(jìn)行比較，匹配到已知miRNA上的Total和Unique clean reads的總數(shù)量分別為29 849 254，37 946。根據(jù)差異miRNA篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2(Fold_Change)|≥1且 Q≤0.05，獲得差異表達(dá)的miRNA 71個(gè)，其中上調(diào)39個(gè)，下調(diào)32個(gè)，其結(jié)果見圖1-A。根據(jù)與肉牛骨骼肌發(fā)育相關(guān)的功能數(shù)據(jù)分析，篩選出表達(dá)量(Transcripts per million，TPM)前10位的差異miRNA分別為bta-miR-1、bta-miR-133a、bta-miR-206、bta-miR-26a、bta-miR-27b、bta-miR-143、bta-miR-378、bta-miR-10b、bta-let-7g、bta-miR-499，其結(jié)果見圖1-B。

2.2 miRNA 數(shù)據(jù)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證sRNA測(cè)序鑒定的miRNA表達(dá)譜，隨機(jī)選取sRNA文庫中已知表達(dá)量的6個(gè)miRNA(bta-miR-196b、bta-miR-200b、bta-miR-11977、Novel_445、Novel_130、Novel_334)，通過qRT-PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，其結(jié)果見圖2。通過比較qRT-PCR與高通量測(cè)序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2)，這6個(gè)miRNA在RNA-Seq和qRT-PCR分析中表現(xiàn)出一致的結(jié)果，表明RNA-Seq的測(cè)序結(jié)果是真實(shí)可靠的。

表2 miRNA測(cè)序表達(dá)量數(shù)據(jù)Tab.2 miRNA sequencing expression data

2.3 bta-miR-133a的保守性分析

使用miRBase數(shù)據(jù)庫檢索出牛在內(nèi)的6個(gè)物種miR-133a的成熟序列，其結(jié)果見表3，miR-133a(UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG)在各個(gè)物種中高度保守。

表3 不同物種 miR-133a 成熟序列Tab.3 The mature sequence of miR-133a in different species

2.4 bta-miR-133a靶基因預(yù)測(cè)和富集分析

通過GO富集和KEGG通路富集分析，篩選出與肉牛骨骼肌發(fā)育相關(guān)的bta-miR-133a，使用

TargetScan 7.2軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，其結(jié)果見表4，預(yù)測(cè)到bta-miR-133a的靶基因594個(gè)，其中排名前10位的靶基因分別為：GNB4、GPM6A、TMEM167A、PLEKHA3、RAP2C、PAX7、ERI2、MAML1、SGPP1、AFTPH。使用DAVID 6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)和KOBAS 3.0(http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/)在線軟件對(duì)預(yù)測(cè)到的bta-miR-133a靶基因進(jìn)行GO富集和KEGG通路富集分析。通過GO富集分析可知(圖3)，bta-miR-133a靶基因顯著富集于細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、胚胎骨骼系統(tǒng)發(fā)育、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織的調(diào)節(jié)、肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合、細(xì)胞連接等與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的GO條目中，其中靶基因PAX7富集于肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合條目中。通過KEGG通路富集分析可知(表5)，bta-miR-133a靶基因顯著富集于黏附連接、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、PI3K-Akt、FoxO、MAPK、Ras、TGF-β等信號(hào)通路與骨骼肌生長發(fā)育密切相關(guān)。使用TargetScan 7.2軟件預(yù)測(cè)到bta-miR-133a與靶基因PAX7的靶標(biāo)位區(qū)2個(gè)，2個(gè)靶標(biāo)位區(qū)相差683個(gè)堿基，詳細(xì)結(jié)合靶標(biāo)位點(diǎn)見表6。

表4 bta-miR-133a的部分預(yù)測(cè)靶基因Tab.4 Some predicted target genes of bta-miR-133a

表5 bta-miR-133a的靶基因在KEGG通路中富集結(jié)果Tab.5 The enrichment results of bta-miR-133a target genes in the KEGG pathway

表5(續(xù))

2.5 bta-miR-133a與靶基因PAX7的靶標(biāo)關(guān)系驗(yàn)證

通過熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性水平，其結(jié)果見圖4，與轉(zhuǎn)染空白載體組相比，轉(zhuǎn)染bta-miR-133a 組極顯著降低熒光素酶活性(P<0.01)，轉(zhuǎn)染bta-miR-133a-mu組的熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。表明bta-miR-133a在PAX73′-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，PAX7是bta-miR-133a的靶基因。

2.6 bta-miR-133a促進(jìn)肌管形成

由圖5可知，誘導(dǎo)分化1 d，各組之間無顯著差異(P>0.05)。誘導(dǎo)分化2 d，與空白組相比，bta-miR-133a過表達(dá)組出現(xiàn)細(xì)胞融合，形成多核細(xì)胞；bta-miR-133a抑制組細(xì)胞融合數(shù)量無明顯變化，大部分依然是單核細(xì)胞。誘導(dǎo)分化5 d，與空白組相比，bta-miR-133a過表達(dá)組有大量肌管形成，肌管直徑明顯增大；bta-miR-133a抑制組開始出現(xiàn)少量肌管，肌管直徑較短。誘導(dǎo)分化6 d，與空白組相比，bta-miR-133a過表達(dá)組肌管直徑明顯增粗，肌管長度增大，數(shù)量增多；bta-miR-133a抑制組肌管的直徑較短，肌管長度較短，數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。

紅色柱狀圖代表生物過程；藍(lán)色柱狀圖代表分子功能；綠色柱狀圖代表細(xì)胞組成；1.RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控；2.轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控；3.細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控；4.胚胎骨骼系統(tǒng)發(fā)育；5.DNA修復(fù)的正調(diào)控；6.肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織的調(diào)節(jié)；7.經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控；8.生長；9.血管生成；10.轉(zhuǎn)化生長因子β受體信號(hào)通路；11.核苷酸結(jié)合；12.受體信號(hào)蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性；13.ATP結(jié)合14.mRNA結(jié)合；15.蛋白質(zhì)異二聚化活性；16.泛素蛋白連接酶結(jié)合；17.蛋白酪氨酸磷酸酶活性；18.肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合；19.核；20.神經(jīng)元投射；21.核質(zhì)；22.細(xì)胞質(zhì)；23.細(xì)胞-細(xì)胞粘附連接；24.細(xì)胞連接。

The red bar graph represents biological process；The blue bar graph represents molecular function；The green bar graph represents cellular component；1.Positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter；2.Positive regulation of transcription；3.Negative regulation of cell proliferation；4.Embryonic skeletal system development；5.Positive regulation of DNA repair；6.Regulation of actin cytoskeleton organization；7.Negative regulation of classical Wnt signaling pathway；8.Growth；9.Angiogenesis；10.Transforming growth factor beta receptor signaling pathway；11.Nucleotide binding；12.Receptor signaling protein serine/threonine kinase activity；13.ATP binding；14.mRNA binding；15.Protein heterodimerization activity；16.Ubiquitin protein ligase binding；17.Protein tyrosine phosphatase activity；18.Actin filament binding；19.Nucleus；20.Neuron projection；21.Nucleoplasm；22.Cytoplasm；23.Cell-cell adherens junction；24.Cell junction.

2.7 成肌細(xì)胞增殖率檢測(cè)

轉(zhuǎn)染后，分別在24，48，72 h進(jìn)行CCK-8細(xì)胞增殖率檢測(cè)。由圖6可知，24 h，各處理組之間無顯著差異(P>0.05)。48 h，與空白組相比，bta-miR-133a過表達(dá)組顯著降低成肌細(xì)胞的增殖率(P<0.05)；bta-miR-133a抑制組無顯著差異(P>0.05)。72 h，與空白組相比，bta-miR-133a過表達(dá)組極顯著降低成肌細(xì)胞的增殖率(P<0.01)；bta-miR-133a抑制組顯著提高成肌細(xì)胞的增殖率(P<0.05)。

2.8 過表達(dá)、敲除bta-miR-133a對(duì)靶基因PAX7和增殖分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

轉(zhuǎn)染后，48 h提取細(xì)胞RNA，使用qRT-PCR檢測(cè)PAX7、PCNA、CCND1、Myh1、Myod1的表達(dá)量。由圖7可知，bta-miR-133a過表達(dá)組極顯著抑制靶基因PAX7的表達(dá)(P<0.01)，bta-miR-133a抑制組顯著促進(jìn)PAX7的表達(dá)(P<0.05)。在細(xì)胞增殖方面(圖7-B)，bta-miR-133a過表達(dá)組極顯著抑制PCNA的表達(dá)(P<0.01)，顯著抑制CCND1的表達(dá)(P<0.05)，bta-miR-133a抑制組顯著促進(jìn)PCNA和CCND1的表達(dá)(P<0.05)；在細(xì)胞分化方面(圖7-C)，bta-miR-133a過表達(dá)組極顯著促進(jìn)Myod1和Myh1的表達(dá)(P<0.01)，bta-miR-133a抑制組顯著抑制Myod1的表達(dá)(P<0.01)，對(duì)Myh1的表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05)。

3 討論與結(jié)論

骨骼肌的生長發(fā)育過程大致分為成肌細(xì)胞分化形成階段、成肌細(xì)胞遷移增殖階段和肌管形成階段，涉及多基因表達(dá)和信號(hào)途徑調(diào)控，過程極其復(fù)雜，miRNAs則是該過程的重要調(diào)控因子[16-18]。研究表明，miRNAs參與了幾乎所有細(xì)胞過程的調(diào)控，關(guān)于miRNAs在骨骼肌發(fā)育中的潛在機(jī)制和作用的研究也越來越多，大多采用高通量測(cè)序建庫結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法[19-21]。本研究以動(dòng)物胚胎工程中心實(shí)驗(yàn)室建立的布萊凱特黑牛和魯西黃牛背最長肌測(cè)序小RNA文庫為數(shù)據(jù)背景，采用GO富集和KEGG通路富集分析篩選出與肉牛骨骼肌發(fā)育密切相關(guān)的差異miRNAs(bta-miR-1、bta-miR-133a、bta-miR-206、bta-miR-26a、bta-miR-27b、bta-miR-143、bta-miR-378、bta-miR-10b、bta-let-7g、bta-miR-499)，選取TPM表達(dá)量較高的bta-miR-133a作為研究對(duì)象。據(jù)報(bào)道，從人和小鼠肌肉組織中克隆鑒定出肌肉特異性miR-206，可以促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞分化，抑制小鼠C2C12細(xì)胞增殖[22]。同時(shí)在Ling等[23]的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-27b可通過調(diào)控PAX3基因促進(jìn)山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化而抑制細(xì)胞增殖。miR-378a的水平升高會(huì)抑制成肌抑制因子，進(jìn)而正反饋調(diào)控Myod促進(jìn)成肌分化[24]，敲除miR-378a會(huì)影響骨骼肌中脂肪酸和葡萄糖氧化的能量代謝，進(jìn)而影響肌纖維類型的發(fā)育[25]。本研究通過保守性分析，比對(duì)不同物種miR-133a成熟序列(UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG)的同源性，發(fā)現(xiàn)miR-133a在各個(gè)物種中高度保守，表明miR-133a在生物進(jìn)化過程中可能具有重要功能。通過生物信息學(xué)在線網(wǎng)站分析，預(yù)測(cè)到bta-miR-133a靶基因594個(gè)，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)結(jié)果排名前10的靶基因(GNB4、GPM6A、TMEM167A、PLEKHA3、RAP2C、PAX7、ERI2、MAML1、SGPP1、AFTPH)中，多與癌癥相關(guān)，例如：GPM6A在肺癌組織中低表達(dá)會(huì)影響患者預(yù)后，GPM6A可作為預(yù)測(cè)肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移及判斷預(yù)后的有效分子標(biāo)記物[26]；RAP2C與腦膠質(zhì)瘤[27]、喉鱗狀細(xì)胞癌[28]、乳腺癌[29]等癌癥發(fā)展相關(guān)；AFTPH被認(rèn)為是乳腺浸潤癌(BRCA)、肺鱗癌(LUSC)和胰腺癌(PAAD)的潛在治療靶標(biāo)和預(yù)后生物標(biāo)志物[30]。靶基因PAX7主要參與心肌與骨骼肌的生長發(fā)育，在成年期和肌肉再生過程中起主要作用，對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞的生物發(fā)生和存活至關(guān)重要[31-32]。同時(shí)也有研究表明，PAX7可通過與肌肉調(diào)節(jié)因子家族成員之間的交叉抑制，維持著衛(wèi)星細(xì)胞的自我更新，從而決定了骨骼肌維持和修復(fù)所必需的增殖、分化和自我更新[33-34]。以上研究分析表明，PAX7與肌肉生長發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制的功能相關(guān)性較強(qiáng)，因此，選取PAX7作為bta-miR-133a的靶基因進(jìn)行下一步的研究。此外，bta-miR-133a的預(yù)測(cè)靶基因PLEKHA3和ERI2在目前的研究中報(bào)道較少，功能尚待進(jìn)一步研究。

基于本試驗(yàn)是探究不同品種間肉牛骨骼肌生長發(fā)育的分子機(jī)制，對(duì)bta-miR-133a靶基因進(jìn)行GO富集和KEGG通路富集分析，推測(cè)這些靶基因的潛在生物學(xué)功能。發(fā)現(xiàn)bta-miR-133a靶基因主要顯著富集在細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織的調(diào)節(jié)、胚胎骨骼系統(tǒng)開發(fā)、肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合等GO條目中和MAPK、PI3K-Akt、FoxO、Ras、TGF-beta、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)等與骨骼肌發(fā)育密切相關(guān)的信號(hào)通路中。MAPK信號(hào)通路由4個(gè)亞家族組成，其中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)主要調(diào)控細(xì)胞生長和分化，且Ras信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路中的信號(hào)蛋白存在聯(lián)系，共同參與調(diào)控肌肉的發(fā)育過程；IGF1通過介導(dǎo)PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖和骨骼肌生長[35-36]；FoxO 信號(hào)通路中的FOXO1、FOXO3和FOXO32廣泛參與肌肉的生長發(fā)育過程[37]；TGF-β信號(hào)通路中的TGFβ2、TGFβ3可抑制衛(wèi)星細(xì)胞的分化，進(jìn)而影響骨骼肌的生長發(fā)育[38]；靶基因PAX7富集在肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合的GO條目和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的KEGG通路中，表明bta-miR-133a與骨骼肌的發(fā)育過程密切相關(guān)，且可能通過靶基因PAX7參與調(diào)控該過程。已有研究表明，PAX7是維持靜止的衛(wèi)星細(xì)胞和肌肉再生所必需的基因[39-40]，可作為關(guān)鍵上游調(diào)節(jié)因子參與肌肉的生長發(fā)育過程[41]，發(fā)揮著維持骨骼肌再生和修復(fù)的作用。進(jìn)一步研究表明，PAX7與骨骼肌的生長發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制的功能相關(guān)性最強(qiáng)，因此，選取PAX7作為bta-miR-133a的靶基因。

基于上述分析討論，預(yù)測(cè)bta-miR-133a的種子序列(CCUGGUU)與靶基因PAX7的靶標(biāo)結(jié)合位區(qū)有2個(gè)，都位于3′ UTR區(qū)，中間相差683個(gè)堿基。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，bta-miR-133a與PAX7存在靶向關(guān)系，證明了PAX7是bta-miR-133a的靶基因。在試驗(yàn)開展前考慮到bta-miR-133a運(yùn)用的局限性，進(jìn)行了bta-miR-133a的PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該miRNA在小鼠和牛組織上的片段擴(kuò)增不受影響，且在前人的相關(guān)研究中，已有相類似的細(xì)胞模型驗(yàn)證試驗(yàn)，Kong等[42-43]研究發(fā)現(xiàn)，miR-17在小鼠C2C12細(xì)胞和牛的骨骼肌成肌細(xì)胞中，皆發(fā)揮著促進(jìn)成肌細(xì)胞分化的相同作用；在miR-143、miR-24-3p等miRNA上也有相類似的研究[44-46]。因此，本試驗(yàn)以小鼠C2C12細(xì)胞作為細(xì)胞模型，進(jìn)行細(xì)胞功能驗(yàn)證試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染Blank、NC mimic、bta-miR-133a mimic、NC inhibitor和bta-miR-133a inhibitor，誘導(dǎo)分化后發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化5 d，與空白組相比，bta-miR-133a過表達(dá)組的細(xì)胞有大量肌管形成，肌管長度較長，而轉(zhuǎn)染bta-miR-133a抑制組形成的肌管較少，大部分成肌細(xì)胞還在融合中，表明bta-miR-133a過表達(dá)組的成肌細(xì)胞向肌管分化的進(jìn)程加快，而bta-miR-133a抑制組被抑制。在成肌細(xì)胞分化的過程中，觀察到bta-miR-133a對(duì)肌管形成前期的作用效果并不明顯，但在誘導(dǎo)分化5 d后，觀察到各個(gè)處理組之間的細(xì)胞形態(tài)差異最明顯，表明bta-miR-133a對(duì)成肌細(xì)胞分化的作用明顯；在誘導(dǎo)分化6 d后，觀察到bta-miR-133a抑制組的肌管直徑顯著增大、長度增長，表明轉(zhuǎn)染bta-miR-133a inhibitor導(dǎo)致肌管形成的高峰期延后。雖然bta-miR-133a抑制組的成肌細(xì)胞分化過程較慢，但各個(gè)處理組的成肌細(xì)胞均進(jìn)入肌管形成過程，最終形成肌管，表明bta-miR-133a inhibitor可以在一定程度上抑制成肌細(xì)胞分化，減緩其分化速度，但無法直接阻斷成肌細(xì)胞的融合分化。綜上表明，bta-miR-133a促進(jìn)肌管分化，且主要在肌管形成后期發(fā)揮作用，這與邢義珅[47]、秦瑞峰等[48]、陳永樂等[49]研究報(bào)道的關(guān)于成肌細(xì)胞增殖分化的過程相一致。采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖率發(fā)現(xiàn)bta-miR-133a過表達(dá)組抑制細(xì)胞增殖的速率在24～48 h最大，bta-miR-133a抑制組促進(jìn)細(xì)胞增殖的速率也在24～48 h最大，表明bta-miR-133a抑制成肌細(xì)胞增殖，且主要在細(xì)胞增殖的前期發(fā)揮主要作用。

研究表明，關(guān)于miRNAs對(duì)成肌細(xì)胞增殖分化方面的研究多采用增殖標(biāo)志性基因PCNA、CCND1和分化標(biāo)志性基因Myod1、Myh1的表達(dá)量來反映成肌細(xì)胞增殖分化的程度[50-53]。通過qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48 h成肌細(xì)胞中增殖標(biāo)志性基因PCNA、CCND1和分化標(biāo)志性基因Myod1、Myh1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，轉(zhuǎn)染bta-miR-133a minic，極顯著抑制PCNA，顯著抑制CCND1的表達(dá)，極顯著促進(jìn)Myod1和Myh1的表達(dá)；轉(zhuǎn)染bta-miR-133a inhibitor，顯著促進(jìn)PCNA和CCND1的表達(dá)，顯著抑制Myod1的表達(dá)。表明bta-miR-133a參與調(diào)控增殖細(xì)胞中DNA的復(fù)制過程[54]，抑制細(xì)胞從G1期到S期的過程；促進(jìn)肌球蛋白的合成，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞向成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終融合形成肌管[55]?；谝陨显囼?yàn)結(jié)果分析表明，bta-miR-133a抑制成肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。通過qRT-PCR檢測(cè)PAX7的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)bta-miR-133a抑制PAX7表達(dá)，與Nguyen等[56]在尼羅羅非魚骨骼肌發(fā)現(xiàn)的miR-133a與假定靶基因PAX7的負(fù)調(diào)控關(guān)系相一致。有的研究報(bào)道PAX7基因的表達(dá)量下降會(huì)促進(jìn)成肌細(xì)胞分化[41]，進(jìn)一步表明bta-miR-133a促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。

本研究選取bta-miR-133a的目標(biāo)靶基因時(shí)，結(jié)合了生物學(xué)信息分析以及相關(guān)功能性研究，雖然只選取了PAX7，但是已有研究表明bta-miR-133a對(duì)成肌細(xì)胞的增殖分化過程的調(diào)控可能不僅僅通過靶基因PAX7，也可能通過調(diào)控其他調(diào)節(jié)因子來參與骨骼肌的發(fā)育過程。在該過程中，miR-133可通過靶向調(diào)控血清反應(yīng)因子(SRF)[57]、NPTB[58]或者UCP2[59]來參與肌細(xì)胞增殖分化過程。因此，bta-miR-133a與PAX7以及其他靶基因的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需要進(jìn)行深入的探索。

bta-miR-133a可能通過抑制靶基因PAX7的表達(dá)，抑制成肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)肉牛骨骼肌的生長發(fā)育。